تقديم

به خداوندي که مرا آفريد
قدرت تفکرم بخشيد و خانه درونم را به نور آموختن روشن فرمود
به پيامبر علم و رحمت
محمد رسول الله (صلي الله عليه و آله و سلم)

و به آنان که مهر آسماني شان آرام بخش آلام زميني ام است
به استوارترين تکيه گاهم،دستان پرمهر پدرم
به مهربانترين نگاه زندگي ام، وسعت بيکران چشمان مادرم
و به همسر مهربانم
به پاس مهر بيکرانش، همراهي و رهنمونهاي بي دريغش

سپاسگذاري

با سپاس فراوان از راهنمائي‌ها و زحمات استاد محترم و گرانقدر جناب آقاي دکتر کربلايي حيدري که از ابتداي راه و در طي انجام اين تحقيق، با راهنمائي‌هاي خود مرا در نگارش اين اثر ياري نمودند.
همچنين قدر داني و تقدير از اساتيد بزرگوار مشاور ، جناب آقاي دکتر آبسالان و جناب آقاي دکتر يوسفي که با هدايت و حمايت‌هاي بي دريغشان ياري‌ام نمودند.
هم چنين از همه افرادي که به هر نوعي مرا در اجراي اين پژوهش ياري نمودند قدرداني مي نمايم.

چکيده

مطالعه اثر مايعات يوني بر پايداري و فعاليت هيدرولازي آنزيم
ليپاز ترموانروباکتر ترموهيدروسولفوريکوس

به کوشش
مينا صلح طلب

مايعات يوني را ميتوان به عنوان محيط واکنشهاي بيوکاتاليز جايگزينهايي سبز براي حلالهاي آلي به شمار برد. ترکيبات مختلفي از کاتيونها و آنيونها را ميتوان جهت دستيابي به طيف وسيعي از مايعات يوني با ويژگيهاي فيزيکي شيميايي مختلف به کار برد. با توجه به گستره وسيع خصوصيات مايعات يوني، نياز است که مايعات يوني مناسب براي هر آنزيم خاص و هر محيط واکنش خاص مشخص شود. آنزيم ليپاز ترموانروباکتر ترموهيدروسولفوريکوس (TTL) يک ليپاز مقاوم به دما است که اختصاصيت انانتيومري خوبي نسبت به الکلهاي ثانويه دارد. بنابراين از TTL ميتوان به عنوان يک آنزيم بالقوه صنعتي، در انجام واکنش هاي تفکيک مخلوطهاي راسميک استفاده کرد. در اين پژوهش فعاليت هيدرولازي آنزيم TTL در حضور غلظتهاي مختلف مايعات يوني [CnMIM][Br] (12، 6، 4، 2 = n) مورد بررسي قرار گرفت. با توجه به اين موضوع که پايداري دمايي آنزيم در محيطهاي حاوي مايعات يوني يک شرط مهم براي استفاده از اين محيطها در فرآيندهاي صنعتي ميباشد، پايداري دمايي آنزيم از نظر سينتيکي و ساختاري در 10 نوع مايع يوني با کاتيونها و آنيونهاي مختلف مورد بررسي قرار گرفت. نتايج افزايش فعاليت هيدرولازي و پايداري دمايي آنزيم TTL در مايعات يوني نسبت به محيط بافري را نشان ميدهد. غلظت بهينه مايعات يوني [CnMIM][Br] در جهت افزايش فعاليت آنزيمي نيز به دست آمد. نتايج نشان داد که آنزيم TTL به ترتيب در غلظت هاي 3/0، 1 و 3/0 مولار از مايعات يوني [C2MIM][Br]، [C4MIM][Br] و [C6MIM][Br] بهترين فعاليت را داشته است. در حاليکه در مورد مايع يوني [C12MIM][Br] هيچ اثر مثبتي بر فعاليت هيدرولازي آنزيم مشاهده نشد. همچنين مشخص گرديد که نوع کاتيون و نوع آنيون مايعات يوني، شدت اثر آنها بر پايداري آنزيم TTL را تحت تأثير قرار ميدهد. نوع آنيون به دليل اندازه کوچک و چگالي بار بالايي که دارند، اهميت بيشتري نسبت به نوع کاتيون دارد. در مقايسهاي که بين مايعات يوني [C4MIM][PF6] و [C4MIM][Br] در دماهاي بالا (°C 85 و °C 90) انجام شد، مايع يوني داراي آنيون PF6- اثر پايدارکننده بيشتري را براي آنزيم TTL ايجاد کرد. پايداري آنزيم در حضور مايعات يوني با طول زنجيره آلکيلي کوتاه و متوسط، مشابه بود. هرچند مايعات يوني با زنجيره کاتيوني طويل اثر منفي بر پايداري ساختار آنزيم ميگذارند. همچنين در اين پژوهش نشان داده شد با تغيير نوع کاتيون از پايه ايميدازوليوم به پايه پيريدينيوم تغيير زيادي در ميزان پايداري ديده نميشود. مطالعات ساختاري پايداري دمايي آنزيم پس از حرارتدهي در °C 85، با روش اسپکتروسکوپي فلورسانس نيز انجام شد. مطالعه فلورسانس ذاتي TTL نشان داد که در مايعات يوني با آنيون PF6- ساختار آنزيم تا حد زيادي حفظ ميشود؛ به طوري که تفاوت کمي بين شدت نشر فلورسانس قبل و بعد از 1 ساعت حرارتدهي در °C 85 ديده ميشود. در مايعات يوني [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] بعد از 45 دقيقه آنزيم همچنان بيش از 50 % از فعاليت خود را حفظ کرد. اين درحالي است که پايداري آنزيم در محيط آبي در دماهاي بالاتر از °C 80 کمتر از 15 دقيقه است. با توجه به يافته هاي پژوهش حاضر، مي توان از آنزيم TTL براي کاتاليز فرايندهاي زيستي در مايعات يوني و دماهاي بالا بهره برد.
کلمات کليدي: مايعات يوني، ليپاز، ترموانروباکتر ترموهيدروسولفوريکوس ، پايداري دمايي.

فهرست مطالب

عنوان
صفحه
فصل اول: مقدمه

1-1- آنزيمها
2
1-2- ليپازها
3
1-2-1- ارتباط ساختار آنزيم ليپاز با عملکرد آن
5
1-3- آنزيمها در محيط آلي
6
1-4- مايعات يوني
8
1-5- بيوکاتاليز در مايعات يوني
9
1-5-1- آنزيمها در مخلوطهاي مايع يوني – آب
10
1-5-2- فعاليت آنزيمها در شرايط نسبتا بيآب در مايعات يوني
11
1-5-3- پايداري آنزيمها در مايعات يوني تقريبا بيآب
13
1-5-4- آنزيمها، مايعات يوني، پيوندهاي هيدروژني و فعاليت
13
1-5-5- بيوترانسفورماسيون در محيط مايعات يوني توسط ليپازها و استرازها
14
1-6- بررسي ساختار پروتئين به روش اسپکتروسکوپي فلورسانس
15
فصل دوم: مروري بر پژوهشهاي پيشين

2-1- پيشينه کاربرد مايعات يوني در بيوکاتاليز
18
2-2- اثر مايعات يوني مختلف بر فعاليت و پايداري آنزيم
19
2-3- بررسي ساختار آنزيمها در مايعات يوني
22
اهداف
23
فرضيه
23
فصل سوم: مواد و روشها

3-1- ابزار
25

عنوان
صفحه
3-2- مواد
26
3-2-1- مواد لازم جهت تهيه مايعات يوني
26
3-2-2- مواد لازم جهت تهيه آنزيم ليپاز درون سلولي TTL
26
3-2-2-1- سوش باکتري
26
3-2-2-2- مواد مورد نياز براي ترانسفورماسيون
26
3-2-2-3- مواد مورد نياز براي کشت باکتري و استخراج عصاره سلولي
26
3-2-2-4- مواد مورد نياز براي تخليص آنزيم ليپاز
26
3-2-2-5- مواد مورد نياز براي سنجش کمي ميزان پروتئين و ژل SDS PAGE
27
3-2-3- مواد مورد نياز براي سنجش فعاليت آنزيمي ليپاز
27
3-2-4- نرم افزارها
27
3-3- روشها
28
3-3-1- روش تهيه مايعات يوني
28
3-3-1-1- روش تهيه مايعات يوني با آنيون برميد
28
3-3-1-2- روش تهيه مايعات يوني با آنيون هگزافلوروفسفات
28
3-3-2- روش کشت باکتري و بيان القايي پروتئين نو ترکيب
29
3-3-2-1- محيط کشت باکتري E. coli
29
3-3-2-2- انتقال DNA خارجي به باکتري E.coli
29
3-3-2-2-1- تهيه سلول هاي مستعد به روش شيميايي
29
3-3-2-2-2- انتقال پلاسميد به سلول مستعد
30
3-3-2-3- روش تهيه استوک باکتري
31
3-3-2-4- کشت باکتري و القاي بيان آنزيم نوترکيب
31
3-3-2-5- بهينه سازي بيان آنزيم نوترکيب
31
3-3-2-5- 1- انتخاب بهترين کلني از نظر بيان آنزيم TTL
31
3-3-2-5-2- انتخاب بهترين زمان پس از القا
32
3-3-2-6- استخراج عصاره سلولي حاوي ليپاز TTL
32
3-3-3- روش تخليص آنزيم ليپاز TTL
33
3-3-3-1- روش رسوب دهي دمايي
33
3-3-3-1-1- بهينه سازي رسوب دهي دمايي
33
3-3-3-2- روش تخليص به کمک ستون کروماتوگرافي
33
3-3-4- روش سنجش کمي پروتئين
34
3-3-4-1- سنجش کمي ميزان پروتئين به روش برادفورد
34
3-3-4-2- سنجش کمي ميزان پروتئين به روش جذب nm 280
34

عنوان
صفحه
3-3-5- الکتروفورز ژل پليآکريل آميد با SDS (SDS-PAGE)
35
3-3-5-1- آماده سازي محلولهاي الکتروفور
35
3-3-5-2- آماده سازي سيستم الکتروفورز
36
3-3-6- سنجش فعاليت آنزيمي با سوبستراي پارانيتروفنيل پالميتات
38
3-3-7- روش بررسي فعاليت آنزيمي در حضور غلظت هاي مختلف از انواع مايعات يوني
39
3-3-8- روش بررسي پايداري دمايي آنزيم TTL در دماهاي بالا
39
3-3-9- روش بررسي پايداري آنزيم ليپاز TTL در حضور مايعات يوني مختلف
39
3-3-10- روش بررسي ساختار سوم آنزيم TTL در حضور مايعات يوني
40
فصل چهارم: نتايج

4-1- بهينه سازي بيان آنزيم نوترکيب
42
4-1-1- انتخاب بهترين کلني از نظر بيان آنزيم TTL
43
4-1-2- بهينه سازي زمان پس از القا
43
4-2- تخليص آنزيم ليپاز TTL
44
4-2-1- بهينه سازي تخليص نسبي به روش رسوب دهي دمايي
44
4-2-2- تخليص به کمک ستون کروماتوگرافي Q- سفاروز
45
4-3- سنتز مايعات يوني
47
4-4- اثر مايعات يوني بر فعاليت هيدرولازي آنزيم TTL
47
4-5- اثر مايعات يوني بر پايداري دمايي آنزيم TTL
48
4-5-1- پايداري دمايي TTL در عدم حضور مايعات يوني
48
4-5-2- پايداري دمايي آنزيم TTL در حضور مايعات يوني
49
4-5-2-1- بررسي پايداري TTL در [C4MIM][Br] و ] [C4MIM][PF6 در دماهاي مختلف
49
4-5-2-2- مقايسه اثر نوع آنيون مايعات يوني بر پايداري دمايي
51
4-5-2-3- مقايسه اثر نوع کاتيون و طولهاي مختلف زنجيره کربني مايعات يوني بر پايداري دمايي آنزيم
51
4-6- بررسي ساختار سوم آنزيم در حضور و عدم حضور مايعات يوني
54
فصل پنجم: بحث

5-1- اثر مايعات يوني بر فعاليت هيدرولازي آنزيم TTL
57

عنوان
صفحه
5-2- اثر مايعات يوني بر پايداري دمايي آنزيم TTL
59
5-3- بررسي ساختار سوم آنزيم در حضور مايعات يوني
61
فصل ششم: نتيجهگيري و پيشنهادات

6-1- نتيجهگيري
63
6-2- پيشنهادات
63
فهرست منابع
65
چکيده انگليسي
75

فهرست جدولها

عنوان

صفحه

جدول1-1- ميکروارگانيسمهاي توليد کننده ليپاز
4
جدول2-1- آنيونهاي متداول در مايعات يوني
19
جدول 3-1- محيط کشت Luria Bertani
29
جدول 3-2- نحوه تهيه محلول TSB
30
جدول 3-3- نحوه تهيه محلول KCM
31
جدول 3-4- نحوه تهيه محلول برادفورد
34
جدول 3-5- نحوه تهيه بافر نمونه 4X
37
جدول 3-6- نحوه تهيه ژل پلي اکريل آميد
37
جدول 3-7- نحوه تهيه مخلوط سنجش فعاليت آنزيم
38
جدول 4-1- فعاليتهاي ليپازي عصارههاي سلولي کلنيهاي 1 تا 6 حاصل از ترانسفورماسيون
44
جدول 4-2- مشخصات مراحل تخليص TTL.
46
جدول 5-1- غلظتهاي بهينه مايعات يوني (CnMIM Br n=2,4,6) و CMC هاي مربوطه
58

فهرست شکلها

عنوان

صفحه

شکل 1-1- آنزيم ليپاز ريزوموکور ميهي (PDB entry 3TGL)
6
شکل 1-2- آنيونها و کاتيونهاي مرسوم در مايعات يوني مورد استفاده در بيوکاتاليز
9
شکل 1-3- آنزيم CALB در حضور مايعات يوني بدون آب
12
شکل2-1- ساختارهاي نمونه از کاتيون مايعات يوني معمول در بيوکاتاليز
18
شکل 3-1- سنتز مايعات يوني با آنيون برميد
28
شکل 4-1- وکتور PQE-80L حاوي ژن آنزيم TTL
42
شکل 4-2- بهينه سازي مدت زمان تخليص به روش رسوب دهي دمايي
45
شکل 4-3- کروماتوگرام ستون Q- سفاروز؛ تخليص آنزيم TTL
46
شکل 4-4- تصوير ژل SDS-PAGE 5/12 % از مراحل تخليص آنزيم TTL
47
شکل 4-5- اثر غلظتهاي مختلف مايعات يوني بر فعاليت آنزيمي
48
شکل 4-6- نمودار پايداري آنزيم TTL در دماهاي بالا در بافر تريس mM 50
49
شکل4-7- نمودار پايداري TTL در [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] در دماهاي °C 85 و °C90
50
شکل4-8- نمودار پايداري دمايي TTL در مايعات يوني؛

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید