شده است که يک آناليز زماني با SDS-PAGE براي تشخيص سطح بيان پروتئين در زمانهاي مختلف پس از القا انجام گيرد. محتواي پروتئين درون سلولي به طور معمول داراي يک تعادل بين ميزان پروتئينهاي محلول درون سلول و ميزان پروتئينهاي موجود دراجسام نامحلول و پروتئينهاي در حال خراب شدن است. با بررسي ميزان پروتئين موجود در عصاره سلولي در زمانهاي مختلف پس از القا، ميتوان مدت زمان پس از القا را يافت.
ابتدا از کشت يک شبه باکتري در محيط LB جديد به همراه آمپيسيلين، 1% تلقيح انجام شد و به مدت 4 ساعت در دماي °C 37 با rpm 200 به باکتريها اجازه رشد و تکثير داده شد. زماني که کدورت محيط در طول موج nm 600 به 9/0 رسيد، ابتدا ml1 از باکتريها به عنوان نمونه القا نشده برداشته شد و پس از سانتريفوژ rpm 5000 به مدت 5 دقيقه، رسوب سلولي در ?l 50 بافر نمونه SDS-PAGE با غلظت X1 (جدول 3-5) حل شد. سپس القاي بيان پروتئين با IPTG با غلظت نهايي mM انجام شد. محيط کشت در دماي °C 30 قرار داده شد. پس از گذشت زمان 4، 5، 6 و24 ساعت از القا، ml 1 از محيط کشت نمونهبرداري شد و پس از سانتريفوژ رسوب سلولي در ?l 100 بافر نمونه SDS-PAGE با غلظت X1 (جدول 3-6) حل شد. نمونهها تا زمان انجام SDS-PAGE در 20- نگهداري شد.

3-3-2-6- استخراج عصاره سلولي حاوي ليپاز TTL
سلول هاي فريز شده با قرار گرفتن در دماي اتاق ذوب شدند و سپس به مدت 2 تا 3 ساعت در حضور آنزيم ليزوزيم با غلظت نهايي mg/ml 1/0 انکوبه شدند. آنگاه هر ml 5 از محلول باکتريها با استفاده از دستگاه سانيکاتور با شدت % 60 در مراحل 30 ثانيه اي با رعايت فواصل زماني 1 دقيقه اي که محلول در يخ قرار داده مي شد، در مجموع به مدت 4 دقيقه سانيکيت شدند. سپس پروتئين هاي دناتوره شده، غشاهاي سلولي و ساير عوامل نامحلول به کمک سانتريفوژ با دور rpm 8500 به مدت 10 دقيقه جدا سازي شدند و محلول رويي به عنوان مخلوط پروتئيني حاوي آنزيم ليپاز مورد استفاده قرار گرفت.

3-3-3- روش تخليص آنزيم ليپاز TTL
3-3-3-1- روش رسوب دهي دمايي
در مرحله اول تخليص، با توجه به مقاومت دمايي آنزيم TTL، رسوب دهي دمايي مخلوط پروتئيني در دماي °C 65 در بن ماري به مدت 40 دقيقه و بلافاصله يخ گذاري به مدت 30 دقيقه به منظور حذف پروتئين هاي غير مقاوم به دما انجام گرديد. سپس با سانتريفوژ دور rpm 13000 پروتئينهاي دناتوره شده رسوب داده شدند و محلول رويي به عنوان نمونه پروتئيني با خلوص نسبي مورد استفاده قرار گرفت. مقداري از آنزيم نيز جهت استفاده به صورت پودر خشک به کمک دستگاه فريزدراير86 ليوفيليز شد87.
3-3-3-1-1- بهينه سازي رسوب دهي دمايي
جهت انتخاب بهترين زمان حرارتدهي براي رسيدن به بيشترين خلوص ممکن و ايجاد کمترين آسيب به آنزيمهاي TTL موجود در مخلوط پروتئيني، عصاره سلولي باکتري حاوي پروتئين نوترکيب (TTL)، به 6 بخش تقسيم شد و هر کدام به مدت زمان مشخصي (30، 40، 50، 60، 70 و 80 دقيقه) در دماي °C 65 قرار داده شد. پس از يخگذاري نمونهها، پروتئينهاي دناتوره شده به کمک سانتريفوژ جدا شدند و ?g 12 از پروتئينهاي مقاوم به حرارتدهي باقيمانده در محلول مربوط به 6 نمونه، به همراه بافر نمونه حاوي رنگ، وارد چاهکهاي SDS-PAGE شد(بخش 3-3-5) و بهينه مدت زمان رسوبدهي دمايي مشخص گرديد.

3-3-3-2- روش تخليص به کمک ستون کروماتوگرافي
در اين مرحله از ستون کروماتوگرافي تعويض آنيوني Q- سفاروز با شيب نمکي سديم کلريد در محدوده 0 تا 5/0 مولار در pH 8 بافر تريس استفاده شد. پس از تشخيص غلظت بهينه نمک براي جداسازي آنزيم TTL(حدود غلظت 15/0)، به صورت مرحلهاي و طي 3 مرحله غلظتي از نمک سديم کلريد (مرحله اول: غلظت 0، مرحله دوم: غلظت 1/0 مولار، مرحله سوم: غلظت 15/0 مولار) آنزيم TTL از ساير پروتئينهاي مخلوط پروتئيني جدا گرديد.

3-3-4- روش سنجش کمي پروتئين
در اين پژوهش از دو روش مختلف جهت اندازه گيري کمي ميزان پروتئين استفاده شد:
3-3-4-1- سنجش کمي ميزان پروتئين به روش برادفورد
محلول برادفورد طبق جدول 3-5 تهيه گرديد. ابتدا پودر کوماسي بلو به مدت 1 تا 2 ساعت در تاريکي با اتانول بر روي استيرر حل ميکنيم. در ادامه اسيد فسفريک را به آن افزوده و حجم آن را با آب مقطر به 1000 ميليليتر ميرسانيم. سپس محلول برادفورد تهيه شده را با کاغذ واتمن فيلتر کرده و در ظرف تيره نگهداري ميکنيم.

جدول 3-5- نحوه تهيه محلول برادفورد
مواد مورد نياز
مقدار
Comassie Brilliant Blue G-250
1/0 گرم
اتانول 95%
50 ميليليتر
فسفريک اسيد 85%
100 ميليليتر

در روش برادفورد در اثر برهمکنش اختصاصي رنگ کوماسي بلو G-250 با آمينواسيدهاي آروماتيک پروتئين (آرژينين، تريپتوفان، تيروزين، هيستيدين، فنيلآلانين) در محلول اسيدي (در فرم آنيوني آمينواسيدها)، رنگ آبي ايجاد ميشود که شدت اين رنگ در غلظتهاي کم پروتئين نزديک به قهوهاي و در غلظتهاي بالا آبي تيره است. ميزان جذب نوري محلول پروتئيني به همراه معرف رنگي در 595 نانومتر خوانده ميشود که بسته به غلظت پروتئين، مقدار جذب اندازهگيري شده در اين طول موج، متفاوت است. براي تعيين غلظت کمي پروتئين ها، ابتدا µl 100 از غلظت هاي مختلف BSA (g/mlµ20،40،60،80،100) تهيه شد و براي تهيه نمودار استاندارد مورد استفاده قرار گرفت. سپس از نمونههاي حاوي پروتئين مورد سنجش نيز به حجم نهايي 100 ميکروليتر، رقتهايي تهيه کرده و يک ميليليتر از معرف برادفورد به هر کدام از نمونهها اضافه گرديد. طي مدت زمان 5 تا 15 دقيقه پس از افزودن معرف برادفورد جذب آنها در 595 نانومتر خوانده شد. سپس جذب نوري به دست آمده براي پروتئين نامعلوم، بر اساس معادله خط به دست آمده از نمودار استاندارد، به غلظت پروتئيني تبديل گرديد.

3-3-4-2- سنجش کمي ميزان پروتئين به روش جذب nm 280
در اين روش با اندازه گيري ميزان جذب نوري محلول پروتئين در طول موج nm 280 ميزان پروتئين را تعيين مي کنيم. اين روش بر اساس ميزان جذب نوري آمينواسيد هاي آروماتيک مانند تيروزين طراحي شده است.

3-3-5- الکتروفورز ژل پليآکريل آميد با SDS88(SDS-PAGE)
اين روش به طور معمول براي بررسي مراحل خالص سازي، محاسبه مقدار نسبي و تعيين وزن مولکولي پروتئينها و پپتيدها بکار ميرود. قابليت تفکيککنندگي بسيار بالاي روش SDS-PAGE عمدتاً ناشي از وجود SDS و ويژگي مناسب ژل پلياکريل آميد در غربال پروتئينهاي مختلف است. در اين روش پروتئينها بر اساس اندازه از هم جدا ميشوند. با جوشاندن نمونهها و گذاشتن آنها در شرايط احيا، اين ملکولها خطي شده و SDS به آنها بار منفي ميدهد، که ميزان بار منفي بسته به طول آنها متفاوت خواهد بود. بنابراين پروتئينها به اين صورت بر اساس اندازهشان در ميدان الکتريکي ايجاد شده با سرعتهاي متفاوتي حرکت کرده و از هم جدا ميشوند. مراحل اين نوع الکتروفورز بر اساس دستورالعمل ارائه شده در Qiagen Protocols و به شرح زير انجام گرديد:

3-3-5-1- آماده سازي محلولهاي الکتروفورز
محلول استوک اکريل آميد (8/30 %): 30 گرم اکريل آميد و 8/0 گرم بيس اکريل آميد در حدود 50 ميليليتر آب حل شد و سپس حجم نهايي آن به 100 ميليليتر رسيد. محلول در ظرف تيره نگهداري شد (اين محلول تا 3 ماه در يخچال قابل استفاده است).
بافر ژل پايين (ژل جدا کننده)89: اين بافر داراي غلظت 5/1 مولار تريس با 8/8~pH است. براي تهيه آن 2/18 گرم تريس- باز در حدود 70 ميليليتر آب مقطر حل شد. pH آن با اسيد کلريدريک 2 مولار تا 8/8 پايين آمد و حجم نهايي با آب مقطر به 100 ميليليتر رسيد.
بافر ژل بالا (ژل متراکم کننده)90: اين بافر داراي غلظت 5/0 مولار تريس با 8/6~pH است. براي تهيه آن 1/6 گرم تريس باز در حدود 50 ميليليتر آب مقطر حل شد. pH آن با اسيد کلريدريک 2 مولار تا 8/6 پايين آمد و حجم نهايي با آب مقطر به 100 ميليليتر رسيد.
بافر الکتروفورز: 5/1 گرم تريس- باز، 2/7 گرم گليسين و 5/0 گرم SDS در 500 ميليليتر آب مقطر حل شد. pH اين بافر حدود 3/8 است.
APS 10%: 1/0 گرم APS در يک ميليليتر آب مقطر حل شد (اين محلول بايد تازه تهيه شود).
TEMED 100%
بافر نمونه (4X): طبق جدول 3-5 تهيه گرديد.
محلول رنگآميزي: 05/0 گرم کوماسي آبي 250-R در 40 ميليليتر متانول حل شد و محلول به مدت 1 ساعت در تاريکي روي استيرر بهم خورد. سپس 10 ميليليتر اسيد استيک گلاسيال و 50 ميليليتر آب مقطر به آن اضافه گرديد. غلظت رنگ در اين محلول 05/0% وزني/ حجمي است. قبل از استفاده محلول رنگ با کاغذ واتمن صاف شد و در ظرف تيره نگهداري ميشود.
محلول رنگبر: 15 ميليليتر متانول، 10 ميليليتر اسيد استيک گلاسيال و 75
ميليليتر آب مقطر با هم مخلوط شدند (بالا بردن نسبت متانول رنگبري را تسريع ميکند. با اين حال بايد توجه داشت که اگر ژل مدت طولاني در محلولهايي با درصد بالاي متانول قرار گيرد، باندهاي پروتئيني نيز بيرنگ ميشوند).

3-3-5-2- آماده سازي سيستم الکتروفورز
يک قالب شيشهاي به کمک صفحات شيشهاي کاملاً تميز و فاصلهاندازها91 که با توجه به ضخامت مورد نياز ژل انتخاب شده اند، ايجاد شد و با چند گيره محکم گرديد. به انتهاي صفحات شيشهاي به اندازه 2/0 سانتيمتر آگار مذاب 5/0% اضافه شد.
محلول ژل پايين (ژل جدا کننده): مقادير مورد نياز براي تهيه ژل با درصد مشخص در جدول 3-6 آورده شده است. پس از افزودن مواد، محلول را به سرعت بهم زده و با دقت در قالب شيشهاي تا ارتفاع مناسبي ريخته شد، به طوريکه حدود 3 سانتيمتر فضا براي ژل بالا باقي ماند. سپس به آرامي از کناره شيشه روي سطح ژل اتانول اضافه گرديد (اين کار به منظور صاف شدن ژل و جلوگيري از چين خوردن در اثر خشک شدن به دليل تماس هوا با آن است). انعقاد ژل پايين معمولاً 45-15 دقيقه طول ميکشد.
محلول ژل بالا (ژل متراکم کننده) طبق جدول 3-6 تهيه شد ، بعد از انعقاد ژل پايين، اتانول روي ژل پايين کاملاً خالي شد و پس از تهيه محلول ژل بالا و هم زدن آن، سريعاً تا ارتفاع مناسب روي ژل پايين ريخته شد. سپس شانه در ژل بالا قرار گرفت، به صورتي که حدود 5/1 سانتيمتر از سطح ژل پايين فاصله داشت. انعقاد ژل بالا حدود 45-60 دقيقه طول ميکشد.
پس از خارج ساختن فاصلهانداز پايين از حد فاصل شيشهها، قالب شيشهاي با چند گيره به تانک الکتروفورز متصل گرديد و مخازن بالا و پايين تانک با بافر الکتروفورز پر شد (به وسيلهي يک سرنگ حبابهاي هوا در حد فاصل شيشهها خارج شد)، سپس شانه به آرامي خارج و درون چاهکها با تزريق بافر الکتروفورز تميز گرديد.
براي آماده سازي نمونههاي پروتئيني، يک حجم بافر نمونه به 3 حجم نمونهي پروتئين حاوي 6 تا 20 ميکروگرم پروتئين اضافه شد (بافر نمونه 4x) و به مدت 5 دقيقه در دماي ?C 100 قرار داده شد. سپس حجم مناسبي از آن (حداکثر 40 ميکروليتر) به کمک سمپلر وارد چاهک شد.
کابلها به الکترودهاي مربوطه وصل گرديد. براي الکتروفورز در جريان الکتريکي ثابت، شدت جريان 30-20 ميليآمپر براي يک ميني ژل مناسب است. در صورت استفاده از ولتاژ ثابت، ولتاژ 150-100 ولت مناسب ميباشد. جريان برق قبل از رسيدن رنگ نشانگر به انتهاي ژل قطع شد (حدود 5/2-5/1 ساعت).
بعد از قطع جريان، قالب شيشهاي از تانک جدا گرديد و با فرو بردن يک فاصلهانداز به حد فاصل شيشهها و حرکت آرام آن، شيشهي بالا برداشته شد و سپس ژل درون يک ظرف مناسب قرار گرفت.
حجم کافي از محلول رنگ (100 ميليليتر) به ژل اضافه شد.
محلول رنگ تخليه و سپس ژل را شسته و حجم مناسبي از محلول رنگبر (100 ميليليتر) به آن اضافه گرديد. اگر زمينهي ژل تيره بود تا شفاف شدن آن از محلول رنگبر تازه

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید