همکاران در غلظتهاي کمتر از غلظت آستانه تشکيل ميسل در مايع يوني، افزايش غلظت مايعات يوني با افزايش رسانايي محلول در ارتباط است و پس از اين غلظت اين رابطه ديده نميشود (Sirieix-Plenet et al., 2004) پس بر اساس اين مشاهدات ميتوان غلظت آستانه تشکيل ميسل را به دست آورد. غلظتهاي آستانه تشکيل ميسل و همچنين غلظتهاي بهينه مايعات يوني براي فعاليت آنزيمي حاصل از پژوهش حاضر در جدول 5-1 آمده است. غلظتهاي بهينه به دست آمده براي افزايش فعاليت هيدرولازي آنزيم TTL در حضور مايعات يوني در مورد [C2MIM][Br] و [C6MIM][Br] کمتر ازCMC هاي گزارش شده براي اين مايعات يوني است و در مورد مايع يوني [C4MIM][Br] نيز غلظت بهينه در نزديکي CMC مربوطه قرار دارد. بنابراين تا زماني که غلظت مايعات يوني کمتر از مقادير CMC مربوطه است، مايعات يوني ميتوانند باعث افزايش فعاليت آنزيمي شوند. با افزايش غلظت مايع يوني از ميزان CMC مربوطه مهار فعاليت آنزيمي را ميتوان مشاهده کرد.

جدول 5-1- غلظتهاي بهينه مايعات يوني (CnMIM Br n=2,4,6) و CMC هاي مربوطه
مايعات يوني
غلظت بهينه (mM)
CMC (mM)
[C2MIM][Br]
300
1900 (Goodchild I., 2007)
[C4MIM][Br]
1000
970 (Wang J. J., 2007)
[C6MIM][Br]
300
770 (Wang J. J., 2007)

مطالعات اندکي در رابطه با بررسي اثر تجمع مايعات يوني بر فعاليت آنزيمي انجام شده است. در اين رابطه ميتوان مطالعهاي توسط Geng را نام برد که ساختار پروتئين 96BSA را در کنار غلظتهاي مختلف مايعات يوني مورد بررسي قرار داده است (Geng et al., 2010). نتايج نشان ميدهد که در غلظتهاي کمتر از CMC مايعات يوني برهمکنشهاي الکتروستاتيک با BSA برقرار ميکنند و باعث پايدار شدن ساختار دوم BSA ميشوند. درحاليکه در غلظتهاي بالاتر از CMC شدت آبگريزي مايعات يوني افزايش يافته و با اتصال قوي به BSA ساختار دوم آنرا برهم ميزنند و باعث دناتوره شدن BSA ميشوند. بنابراين ميتوان گفت زماني که غلظت مايع يوني بالاتر از CMC برود تعداد آنزيمهايي که درون ميسلها به دام ميافتند افزايش يافته و بنابر اين آنزيمهاي بيشتري غيرفعال خواهند شد. در رابطه با مايعات يوني که در اين پژوهش مورد بررسي قرار گرفت، افزايش فعاليت هيدرولازي را ميتوان بر اساس برهمکنشهاي هيدروژني و الکتروستاتيک ايجاد شده بين آنزيم و مايعات يوني آبدوست توضيح داد. اين نوع برهمکنشها ميتوانند باعث باز شدن نسبي جايگاه فعال آنزيم و در نتيجه دسترسي بيشتر سوبسترا به محل وقوع واکنش شوند. هرچند اين مايعات يوني به دليل اندازه بزرگ کاتيونها، فضاي محدودي در اطراف آنزيم ايجاد ميکنند که مانع از باز شدن کامل ساختار آنزيم ميشوند. بنابراين در عين افزايش فعاليت آنزيمي در غلظت بهينه مايعات يوني آبدوست، پايداري ساختاري آنزيم نيز در اين مايعات يوني حفظ ميشود. نتايج نشان داد که کاهش فعاليت هيدرولازي TTL در غلظتهاي بالاتري از مايعات يوني داراي زنجيره کوتاهتر کربني مانند [C2MIM][Br] و [C4MIM][Br]، ايجاد ميشود. در حاليکه در مورد مايعات يوني با زنجيره کربني بلندتر مانند [C6MIM][Br]، اين کاهش بلافاصله پس از گذشتن از غلظت بهينه اتفاق ميافتد. کاتيونهاي داراي زنجيره کربني طويل ميتوانند با ايجاد ممانعت فضايي در دهانه جايگاه فعال آنزيم که يک فضاي آبگريز است، مانع از ورود سوبسترا و انجام واکنش شوند. اين پديده ميتواند دليلي براي کاهش فعاليت آنزيم در اثر افزايش غلظت مايعات يوني با طول زنجيرههاي بلندتر باشد (Ventura et al., 2012).
شايان ذکر است که گزارشات موجود در مورد مايعات يوني داراي آنيون برميد غالبا اثر منفي اين نوع از مايعات يوني را بر فعاليت و ساختار آنزيم نشان دادهاند. نوريتومي و همکاران درصد بسيار پائيني از فعاليت آنزيم ليزوزيم را در حضور مايع يوني [C2MIM][Br] نسبت به محيط بافري و مايعات يوني آبگريز گزارش دادند (Noritomi et al., 2011). ساسمال و همکاران [C5MIM][Br] را يک عامل دناتوره کننده براي پروتئين HSA97 دانستند (Sasmal et al., 2011). يان و همکاران تعداد زياد برهمکنشهاي الکتروستاتيک بين مايعات يوني ايميدازوليومي با آنيون برميد و آمينواسيدهاي آسپارتات و گلوتامات پروتئين BSA را علت باز شدن ساختار BSA گزارش دادند (Yan et al., 2012). اين در حالي است که در چنين مطالعاتي اثر غلظت مايعات يوني را بررسي نشده است. مطالعاتي توسط Na در سال 2013 و همچنين Zhao در سال 2006 از معدود مواردي هستند که اين موضوع را مورد توجه قرار دادهاند. در اين بخش از پژوهش نشان داده شد که مايعات يوني با آنيون برميد نيز ميتوانند در غلظتهاي خاصي اثرات مطلوب قابل توجهي بر فعاليت آنزيمي داشته باشند.

5-2- اثر مايعات يوني بر پايداري دمايي آنزيم TTL
يکي از شرايط اصلي که ميبايست براي بهينه سازي انجام يک فرآيند صنعتي مورد بررسي قرار داد، ميزان پايداري آنزيم در شرايط محيطي خاص در دماهاي بالا است. مايعات يوني به عنوان محيط واکنش مناسب در فرآيندهاي صنعتي بسيار مورد توجه قرار گرفتهاند. پايداري دمايي آنزيم در محيطهاي حاوي مايعات يوني يک شرط مهم براي استفاده از اين محيطها در فرآيندهاي صنعتي ميباشد. در اين بخش از پژوهش ابتدا پايداري دمايي آنزيم در محيط آبي و سپس در مخلوطهاي آبي مايعات يوني مختلف مورد بررسي قرار گرفت.
بررسي غيرفعال شدن برگشتپذير آنزيم ليپاز در دماهاي بالا در مايعات يوني [C4MIM][Br] (غلظت 1 مولار) و [C4MIM][PF6] نشان داد که به طور کلي مايعات يوني ايميدازوليومي با هر کدام از آنيونهاي آبدوست و آبگريز، نسبت به محيطهاي بافري محيط بهتري را براي حفظ پايداري آنزيم فراهم ميکنند. هر چند مايعات يوني آبگريز مانند مايع يوني [C4MIM][PF6] نسبت به مايعات يوني آبدوست مانند [C4MIM][Br]، که در اين بخش مورد بررسي قرار گرفت، محيط پايدارکننده بهتري را براي آنزيم TTL ايجاد ميکنند.
اين باور وجود دارد که حلالهاي آلي آبدوست با جذب آب اطراف ملکول آنزيم به سمت خود، باعث باز شدن آنزيم و در معرض قرارگيري باقيماندههاي آبگريز درون ساختار پروتئين ميشوند (Zaks and Klibanov, 1988). مايعات يوني نيز به طور کلي جزء حلالهاي آبدوست و نسبتا قطبي به حساب ميآيند. با اين وجود نتايج به دست آمده از اين پژوهش و همچنين مطالعات ديگر (Liu et al., 2011, Dang et al., 2007, Pan et al., 2010, Ventura et al., 2012) نشان ميدهد که مايعات يوني خصوصا مايعات يوني با کاتيون ايميدازوليوم هرچند با آنيونهاي آبدوست ميتوانند در غلظتهاي کم باعث پايداري و حفظ ساختار آنزيم شوند. اين امر احتمالا به دليل ايجاد شبکههايي از مايعات يوني است که به واسطه کاتيونهاي بزرگ شامل زنجيرههاي کربني آنها ايجاد ميشودو باعث حفظ آنزيم در ساختار طبيعي خود و کاهش انعطافپذيري ساختار آن در طي زمان دمادهي به آنزيم ميشوند. همچنين ميتوان افزايش پايداري آنزيم در حضور اين مايعات يوني را به تغييرات احتمالي ساختار دوم آنزيم ليپاز مرتبط دانست که در مطالعات ساختاري گذشته نشان داده شده است. در پژوهشي توسط De Diego و همکاران ايجاد ساختار فشرده در آنزيم همراه با افزايش تعداد ?-helix و ?-sheet يکي از شواهد پايدار شدن آنزيم در محيط مايعات يوني گزارش شد(De Diego et al., 2005).
نمودار پايداري دمايي آنزيم TTL در مايع يوني [C4MIM][PF6] نيز نشان ميدهد که در هر دو دماي °C85 و °C90 اين نوع مايع يوني به شدت پايداري آنزيم را حفظ ميکند. همانطور که در گزارشات پيش از اين نيز ديده ميشود (Paljevac et al., 2006) طبيعت آبگريز مايع يوني [C4MIM][PF6]، که بيشتر هم به دليل حضور يون PF6- است، ميتواند سبب پايدارسازي آنزيمها شود. اين قابليت بالا احتمالا به دليل توانايي اين مايع يوني در حفظ ملکولهاي آب ضروري در محيط پيرامون آنزيم است (Lozano et al., 2005).
همانطور که گفته شد، مايعات يوني با کاتيون ايميدازوليوم سبب افزايش پايداري آنزيم TTL ميشوند. اين مايعات يوني بسته به نوع آنيوني که در ساختار خود دارند، شدت اثر پايدارکنندگي متفاوتي را از خود نشان ميدهند. در مقايسهاي که در اين پژوهش مقايسهاي بين مايعات يوني [C4MIM][PF6] و [C4MIM][Br] در دماهاي بالا (°C 85 و °C 90) انجام شد، مايع يوني داراي آنيون PF6- اثر پايدارکننده بيشتري را براي آنزيم TTL ايجاد کرد.
نوع برهمکنشهاي بين آنيون مايعات يوني و آنزيم ميتواند شاهد خوبي براي تفسير علت پايداري بيشتر آنزيم در [C4MIM][PF6] باشد. برهمکنشهاي مختلفي که ممکن است بين آنيونها و آنزيم برقرار شود، توسط گروههاي مختلفي براساس پارامترهاي سولواتوکروميک و همچنين قطبيت، اندازه و توزيع بار در زنجيره جانبي آمينواسيدها مورد بررسي قرار گرفته است (Tome et al., 2008). گزارشات مختلفي مبني بر اثر نوع آنيون بر پايداري آنزيم در مايعات يوني وجود دارد. دسته اي از اين مطالعات نحوه اثر آنيونها را بر اساس جايگاه قرارگيري آنها در سري هافميستر توضيح دادهاند. سري هافميستر(شکل 5-1) در واقع نوعي دسته بندي يونها بر اساس قابليت آنها در حل کردن و رسوب دادن پروتئين است (Hofmeister F.,1888). به صورت زير (Zhao et al., 2006):

اثر آنيونها بر اساس اين سري بيشتر از کاتيونها است. در پژوهشي توسط Kumar مايعات يوني داراي آنيون کاسموتروپ و کاتيون کائوتروپ بر اساس سري هافميستر گزينه هاي مناسبي براي پايدار ماندن آنزيمها پيشنهاد شدند (Kumar et al. 2014). هرچند سري هافميستر در برخي موارد صدق نميکند. براي مثال در مورد آنيون PF6- گزارشات مختلفي مبني بر افزايش پايداري آنزيمها در مايعات يوني داراي اين آنيون وجود دارد. از اين جمله ميتوان پژوهش Ha و همکاران را نام برد که پايداري دمايي بسيار خوبي از آنزيم CALB را در حضور مايعات يوني با آنيون PF6- ديدند (Ha et al., 2008). اين در حالي است که جايگاه اين آنيون در سري هافميستر در دسته آنيونهاي کائوتروپ و ناپايدارکننده است. در تفسير چگونگي اثر اين آنيون بر پايداري آنزيم، Klahn با بررسي حلاليت آنزيم CALB در 8 نوع مايع يوني مختلف، علت پايداري بيشتر آنزيم در مايعات يوني داراي آنيون PF6- را آبگريزي بالاي اين آنيون دانست (Klahn et al., 2011). آنيونهاي آبگريز مانند PF6- با آنزيم پيوند هيدروژني برقرار نميکنند و ملکولهاي آب ضروري اطراف آنزيم را حفظ ميکنند. بنابراين آسيبي به ساختار طبيعي آنزيم نميزنند. همچنين در بين آنيونها، آنيونهايي با اندازه کوچکتر و چگالي بار سطحي بيشتر، به تعداد بيشتري در سظح آنزيم تجمع مييابند و بر همکنشهاي الکتروستاتيک قويتري با بارهاي سطحي آنزيم برقرار ميکنند. در اين حالت احتمال باز شدن ساختار طبيعي آنزيم به دليل تعداد بيشتر برهمکنشها با حلال افزايش مييابد. چنين پديدهاي را در مورد مايعات يوني داراي آنيون برميد يا کلريد ميتوان ديد. به طور متقابل آنيونهاي بزرگي مانند PF6- که چگالي بار سطحي کمي دارند، توانايي ايجاد تعداد کمتري برهمکنش الکتروستاتيک با سطح آنزيم دارند. بنابراين کمتر ساختار آنزيم را تحت تاثير قرار ميدهند. با اين حال حفظ پايداري آنزيم در چنين محيطهايي همواره با مشکل حل نشدن آنزيم در مايعات يوني آبگريز همراه بوده است (Klahn et al., 2011). حفظ پايداري آنزيم در مايع يوني [C4MIM][PF6] در دماهاي بالا پيش از اين نيز گزارش شده است (Ha et al., 2008) که با نتايج گزارش شده از پژوهش حاضر مطابقت دارد.
بر اساس نتايج حاصل از بررسي پايداري دمايي آنزيم TTL در مايعات يوني ايميدازوليومي با طولهاي مختلف زنجيره کربني، مايعات يوني با زنجيرههاي 2، 4 و 6 کربنه عملکرد نسبتا مشابهي را در حفظ پايداري آنزيم از خود نشان ميدهند.

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید