کارآيي بالاي واکنشهاي مختلف خواهد داشت. توسعه مايعات يوني ارزانتر نيز باعث افزايش استفاده از آنها در بيوترانسفورماسيونهاي صنعتي خواهد شد. به علاوه بايد اين موضوع را در نظر داشت که سيستمهاي حلالي که بر پايه مايعات يوني هستند قابليت بالايي در انجام ترانسفورماسيونهاي چند کاتاليزوري دارند. براي دستيابي به اين اهداف تلاشهاي جديدي انجام گرفته است.
بدون شک انتظار ميرود که مايعات يوني سبز و زيست سازگار به زودي در دسترس باشند؛ زيرا به کارگيري مايعات يوني در ايجاد صنايع شيميايي سبزتر، امري کاملا ضروري است. اينگونه به نظر ميرسد که انجام بيوترانسفورماسيون در مايعات يوني بسيار اميد بخش است.

فصل دوم

مروري بر پژوهشهاي پيشين

2-1- پيشينه کاربرد مايعات يوني در بيوکاتاليز
اولين گزارش از بيوکاتاليز در محيط مايعات يوني مربوط به سال 2000 است (Cull et al., 2000). اولين کارهاي انجام شده در اين زمينه شامل مايعات يوني متشکل از کاتيونهاي 1و3- دي آلکيل ايميدازوليوم يا N- آلکيل پيريدينيوم و يک آنيون ضعيف کئوردينه کننده بود (شکل2-1و جدول 2-1). اين نوع مايعات يوني هنوز نقش اصلي را در واکنشهاي آنزيمي ايفا ميکنند. هرچند که تحقيقات در حال حاضر بيشتر به سمت مايعات يوني با ساختارهاي جديد گرايش يافته است. تاکنون مقالات مروري خوبي در زمينه بيوکاتاليز در مايعات يوني منتشر شده است که از آن جمله مقاله مروري ون رنتويجک و شلدون و مقالات مروري منيرالزمان را ميتوان نام برد (Van Rantwijk and Sheldon, 2007, Moniruzzaman, 2010 a& b).

شکل2-1- ساختارهاي نمونه از کاتيون مايعات يوني که به طور مرسوم در بيوکاتاليز استفاده ميشوند
(Van Rantwijk and Sheldon, 2007).

جدول2-1- آنيونهاي متداول در مايعات يوني
فرمول ساختاري
علامت اختصاري
نام آنيون
BF4-
BF4-
Tetrafluoroborate
PF6-
PF6-
Hexafluorophosphate
(CF3SO2)2N-
Tf2N
Bis(trifluoromethylsulfonyl)amide
CF3SO3-
TfO
Trifluoromethanesulfonate
CF3COO-
TFA
Trifluoroacetate
CH3SO3-
MeSO3
Methylsulfite
n-C7H15SO3-
HpSO3
Hydrogenthiophosphate
TsO-
TsO
Toluenesulfonate
CH3OSO3-
MeSO4
Methylsulfate
C2H5OSO3-
EtSO4
Ethylsulfate
n-C8H17OSO3-
OctSO4
Octylsulfate
(HO)2PO2-
H2PO4
Dihydrogenphosphate
(CH3O)2PO2-
Me2PO4
Dimethyl phosphate
C2H5O(CH2)2OSO13-
EtOEtSO4
Ethoxyethylsulfate

در بيوترانسفورماسيون غالبا از مخلوط محيط آلي- آبي براي افزايش حلاليت واکنشدهندهها و محصولات آبگريز استفاده ميشود. پايداري و فعاليت آنزيمها در مخلوطهاي آبي مايعات يوني غالبا براساس اثرات هافميستر مورد بررسي قرار ميگيرد. يک مطالعه اوليه روي آنزيم آلکالين فسفاتاز52 مربوط به باکتري اشرشيا کلاي53 در مخلوط آبي [EtNH3][NO3] (قديميترين مايع يوني (Walden, 1914 )) نشان داد که اين مايع يوني در غلظتهاي پايين روي آنزيم اثر فعال کننده داشته است و بيشترين اثر گذاري آن (10 درصد افزايش فعاليت) در غلظت 1/1 مولار ديده شده است. با افزايش غلظت مايع يوني تا قبل از غلظت 80 درصد فعاليت آنزيم به طور برگشت پذير کاهش يافت و پس از آن آنزيم به طور برگشت ناپذيري غير فعال گرديد (Magnuson et al., 1984).

2-2- اثر مايعات يوني مختلف بر فعاليت و پايداري آنزيم
در سالهاي اخير در حوزه بيوکاتاليز در مخلوطهاي مايع يوني- آب کارهاي زيادي در رابطه با طيف وسيعي از آنزيمها و مايعات يوني انجام شده است. به تازگي آنيونهاي ?-آمينواسيدها در مايعات يوني مورد استفاده قرار گرفتهاند. اين آنيونها کاسموتروپ هستند (Zhao, 2006). مايعات يوني تشکيل شده از ?-آمينواسيدهاي D و L و ?- آمينوکربوکسيلاتها54 و کاتيون [C2MIM] در غلظت 5/0 مولار اثر بسيار کمي بر فعاليت آنزيم سوبتيليسين55 داشتند. در حالي که [C2MIM][D-GluO] در غلظت 1 مولار سرعت واکنش را بيش از 60 درصد کاهش داد و [C2MIM][L-GluO] باعث کاهش 80 درصدي سرعت شد (Zhao, 2006). مايع يوني [C4MIM][Cl] در غلظتهاي کمتر از 20 درصد اثر کمي بر آنزيم پراکسيداز ترب سياه56 (HRP) گذاشت در حاليکه در غلظتهاي 25 و 30 درصد کاهش شديد فعاليت و پايداري دمايي آنزيم را نشان داد (Machado and Saraiva, 2005).
آنيون نيترات يک آنيون بي ضرر و بي اثر است با اين وجود مايعات يوني حاوي اين آنيون زياد مورد مطالعه قرار نگرفتهاند. از معدود مطالعات انجام شده در اين زمينه ميتوان پژوهشي روي آنزيم پاپائين57 را نام برد که در حضور 15 درصد [C4MIM][NO3] 50 درصد از فعاليت خود را حفظ کرد. در گزارشي توسط کفتزيک و همکاران دو آنزيم 58CbFDH و ?-گالاکتوزيداز59 مربوط به باسيلوس سيرکولانس60 در حضور 25 درصد [PrNH3][NO3]61 کاملا غيرفعال شدند (Kaftzik et al., 2002). دليل اين غيرفعال شدن را اسيدي شدن pH احتمال دادند.
مايعات يوني حاوي يون [BF4] بسيار مورد استفاده قرار گرفته است. اين آنيون به شدت کائوتروپ است و نسبت به آنيونهايي که قبل از اين گفته شد قدرت کمتري در تشکيل پيوند هيدروژني دارد. اثر [C4MIM][BF4] بر فعاليت HRP توسط ماکادو و همکاران مورد بررسي قرار گرفت. در غلظتهاي کمتر از 20 درصد [C4MIM][BF4] کمترين کاهش فعاليت ديده شد و در غلظت 25 درصد آن 30 درصد کاهش فعاليت ديده شد. ماکادو و همکاران همچنين تغييرات پايداري دمايي HRP را در [C4MIM][BF4] بررسي کردند. در غلظت 10 درصدي مايع يوني، آنزيم HRP با تأخير بيشتري نسبت به محيط آبي در اثر دمادهي غيرفعال شد. در حالي که در غلظت 25 درصد مايع يوني، پايداري آنزيم به شدت کاهش يافت (Machado and Saraiva, 2005).
اولين بيوترانسفورماسيون موفق در يک محيط مايع يوني حاوي 5 درصد آب مربوط به يک مايع يون آبگريز بود. ترمولايزين62، يک آنزيم بسيار پايدار، واکنش سنتز Z- آسپارتام63 را در محيط [C4MIM][BF4] اشباع از بافر کاتاليز کرد؛ سرعت واکنش در اين حالت نسبت به سرعت واکنش در محيط اتيل استات 40 درصد بود (Erbeldinger et al., 2000).
ليپازها به عنوان آنزيمهاي مقاوم به حلالهاي آلي مسلما اولين گزينه انتخابي براي انجام بيوکاتاليز در مايعات يوني بودند. در حقيقت ليپازهاي ميکروبي پايدار مانند CALB (Madeira Lau et al., 2000 , Schofer et al., 2001) و ليپاز سودوموناس کاپاسيا64 (PCL) (Park and Kazlauskas. 2001, Nara et al., 2002) در مايعات يوني از خانواده 1- آلکيل 3- متيل ايميدازوليوم65 و 1- آلکيل پيريدينيوم66، در ترکيب با آنيونهاي BF4- 67، PF6-68، TfO- 69و NTf2- 70 داراي فعاليت کاتاليتيک هستند. نتايج اوليه در اين قبيل کارها معمولا تکرارپذير نبود و اين به دليل حضور ناخالصي باقي مانده طي فرآيند تهيه مايعات يوني بود. ليپازها واکنشهاي ترانساستريفيکاسيون را در اين مايعات يوني با بازده قابل مقايسه با واکنشهاي انجام شده در ترت- بوتيل الکل71 (Madeira Lau et al., 2000)، دياکسان72 (Nara et al., 2002)، يا تولوئن73 (Park and Kazlauskas 2001) را کاتاليز کردند.
ليپاز A کانديدا آنتراکتيکا (CALA) به عنوان يک استثناء در محيط مايعات يوني [C4MPy][BF4] 74 و [C4MIM][NTf2] 10 برابر فعالتر از محيط ديايزوپروپيلاتر75 (DIPE) (Schofer et al., 2001) بود. مايعات يوني خارج از خانوادههاي 1- آلکيل 3- متيل ايميدازوليوم و 1- آلکيل پيريدينيوم به ندرت در فرآيند بيوکاتاليز مورد استفاده قرار گرفتهاند.
ليپازهاي مختلفي براي انجام بيوکاتاليز در مايعات يوني مورد بررسي قرار گرفته اند که از اين ميان ميتوان آنزيمهاي ليپاز CALB (Lozano et al., 2003)،PCL (Itoh et al., 2003)، 76ASL (Schofer et al., 2001)، CALA، RML77 و TLL78 (Schofer et al., 2001) را نام برد. براي مثال دو آنزيم RML و TLL فعاليت خود را در مايع يوني [C4MIM][NTf2] حفظ کردند در حالي که در دو مايع يوني [C4MIM][PF6] و [C4MIM][BF4] غيرفعال شدند (Schofer et al., 2001).
ليپاز CRL79 به طور معمول در محيطهاي بدون آب فعاليت کمي دارد. بر اساس مطالعات انجام شده در رابطه با کاتاليز واکنشهاي مختلف، اين آنزيم در مايعات يوني [C4MIM][PF6] و [C4MIM][BF4] فعاليت خود را حفظ ميکند (Schofer et al., 2001, Kaar et al., 2003). CRL در [C4MIM][PF6] بهترين فعاليت خود را در حضور حداکثر 4/0 مولار آب (يا 5/0=aw براساس ساير گزارشات (Ulbert et al., 2004) نشان ميدهد. همچنين گزارش شده است که CRL واکنش استريفيکاسيون را در محيط بدون آب [C4MIM][PF6] بهتر از محيط ايزواکتان80 کاتاليز ميکند (Yu et al., 2005).
توانايي ليپاز در تحمل مايعات يوني به صورت بيآب يک توانايي عمومي نيست. آنزيم CALB (Schofer et al., 2001, Kaar et al., 2003)و CRL (Kaar et al., 2003) در طيف وسيعي از مايعات يوني امتزاجپذير با آب، حاوي آنيونهاي [MeSO4] (Schofer et al., 2001)، [NO3] (Kaar et al., 2003)، [AcO] يا [lactate] (Sheldon et al., 2002) غيرفعال است. نکته قابل توجه اين است که ليپاز در چنين محيطهايي حل ميشود زيرا حل شدن پروتئين مستلزم شکسته شدن برهمکنشهاي پروتئين- پروتئين و تشکيل اينترکشنهاي قويتر با محيط است. آب نيز چنين عملکردي دارد اما حلالهاي آلي مانند N،N- ديمتيل فرماميد و ديمتيل سولفوکسيد که آنزيمها را در خود حل ميکنند، و در ضمن، گروههاي سطح پروتئين را کوئوردينه ميکنند، عوامل دناتوره کننده قوي محسوب ميشوند.

2-3- بررسي ساختار آنزيمها در مايعات يوني
در گزارشي از ليو و همکاران فعاليت و ساختار آنزيم ليپاز CRL انکوبه شده در 17 نوع مايع يوني مختلف مورد بررسي قرار گرفت. نتايج نشان داد که انتخاب نوع آنيون اثر مهمتري بر فعاليت آنزيم در واکنش استريفيکاسيون داشته است و مايعات يوني محلول در آب اثر منفي بر فعاليت آنزيمي داشتهاند. مطالعات ساختاري اين گروه با روش FTIR تا حدودي تغييرات ساختاري مرتبط با تغييرات فعاليت آنزيم را نشان داد. هرچند افزايش فعاليت ديده شده در برخي موارد را نميتوان با دادههاي تجربي حاصل از بررسي ساختار ارتباط داد (Liu et al., 2013).
در بررسي ساختاري آنزيم لاکاز81 در مخلوط آبي مايعات يوني [C4MIM][TfO]، [C4MPy][TfO]، [TMA][TfO] با روشهاي CD و فلورسانس اثر مثبت مايع يوني [C4MA][TfO] بر پايداري ساختاري آنزيم نسبت به دو نوع ديگر نشان داده شد. در اين مطالعه نتايج مطالعات ساختاري با نتايج حاصل از بررسي فعاليت آنزيمي مطابقت داشتند (Yua et al., 2013).
در مطالعه ساختاري ديگري به کمک فلورسانس و FTIR اثر مايعات يوني ايميدازوليومي محلول در آب بر ساختار دو آنزيم ?- آميلاز باسيلوس ليکنيفورميس82 و آميلوليکوئي فاسينس83 مورد بررسي قرار گرفت. اين بررسي نشان داد که آنزيم ?- آميلاز در محيط بافري و محلول آبي مايع يوني [C4MIM][Cl] لخته شده و دناتوره ميشود. در حاليکه محلول آبي مايع يوني [C6MIM][Cl] به طور قابل ملاحظهاي مانع از دناتوره شدن آنزيم ميشود (Dabirmanesh et al., 2011).

اهداف
بررسي اثر مايعات يوني مختلف روي پايداري و فعاليت آنزيمهاي ليپاز تا حدودي انجام شده است، اما مطالعه اثر طولهاي مختلف زنجيره کاتيوني مايعات يوني روي آنزيم و بررسي چگونگي تغيير ساختار آنزيم و اثر آن بر فعاليت آنزيمي کمتر مورد توجه قرار گرفته است. همچنين با توجه به اثرات متفاوت مايعات يوني بر روي آنزيمهاي مختلف، در اين پژوهش اثر مايعات يوني روي آنزيم ليپاز TTL، يک آنزيم گرمادوست با پتانسيل کاربردهاي صنعتي، مورد بررسي قرار ميگيرد. بنابراين اهداف اين پژوهش عبارتند از:
بررسي اثر

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید