رسوب دهي دمايي؛
تصوير SDS-PAGE 5/12 %.

4-2-2- تخليص به کمک ستون کروماتوگرافي Q- سفاروز
آنزيم TTL به کمک ستون کروماتوگرافي تعويض آنيوني Q- سفاروز با تغيير غلظت نمکي به صورت مرحلهاي، در مرحله M 15/0 نمک سديم کلريد، جداسازي شد (شکل 4-3). تصوير SDS-PAGE مربوطه تخليص کامل اين آنزيم را تأييد نمود (شکل 4-4). جدول 4-2 مشخصات مخلوط پروتئيني و بازده مراحل مختلف تخليص آنزيم TTL را نشان ميدهد. در مرحله نهايي تخليص 5/16 درصد از ميزان اوليه آنزيم باقي مانده است.

شکل 4-3- کروماتوگرام ستون Q- سفاروز؛ تخليص آنزيم TTL.

جدول 4-2- مشخصات مراحل تخليص TTL.

کل محتواي پروتئين
(mg)
واحد آنزيم95
(U)
فعاليت ويژه (U/mg)
بازده
(%)
تخليص
(مرتبه)
عصاره سلولي
20/45
642/5
125/0
100
2/3
رسوبدهي دمايي
83/12
166/5
403/0
6/91
5/2
دياليز
31/12
608/4
374/0
7/81
0/3
ستون Q-سفاروز
277/0
932/0
365/3
5/16
9/26

شکل 4-4- تصوير SDS-PAGE 5/12 % از مراحل تخليص آنزيم TTL؛
1) عصاره سلول قبل از القا، 2) عصاره سلول 6 ساعت بعد از القا، 3) عصاره سلول ( پس از سونيکيت)،
4) محتواي پروتئيني پس از رسوب دهي دمايي، 5) آنزيم خالص پس از ستون Q- سفاروز، 6) مارکر وزن ملکولي پروتئين

4-3- سنتز مايعات يوني
مايعات يوني [C2MIM][Br]، [C4MIM][Br]، [C6MIM][Br]، [C12MIM][Br]، [C4MIM][PF6]، [C6MIM][PF6] بر اساس روش گفته شده در بخش 3-3-1، سنتز شدند. گرانروي اين مايعات يوني با افزايش طول زنجيره افزايش مييابد و مايع يوني [C12MIM][Br] در دماي اتاق به صورت جامد است. مايعات يوني داراي آنيون PF6- به طور کلي گرانروي بيشتري نسبت به مايع يوني داراي آنيون Br- دارند.

4-4- اثر مايعات يوني بر فعاليت هيدرولازي آنزيم TTL
در اين بخش با افزودن مايع يوني با غلظتهاي نهايي مشخص در مخلوط واکنش اثر طول زنجيره آلکيلي کاتيون ([CnMIM] n=2,4,6,12) و غلظتهاي مايع يوني بر فعاليت هيدرولازي آنزيم ليپاز TTL مورد بررسي قرار گرفت. تمامي آزمايشات دو بار تکرار شدند و به دليل نزديک بودن نتايج به هم، از اعداد به دست آمده از دو تکرار ميانگين گرفته شد. در مايعات يوني مورد بررسي، مايعات يوني با زنجيرههاي کوتاه آلکيلي اثر مطلوب بيشتري بر فعاليت آنزيمي داشتهاند و در زنجيرههاي بلند کربني کاهش فعاليت را ميتوان ديد.
همانطور که در نمودار نشان داده شده است(شکل 4-5)، با افزايش غلظت مايعات يوني در ابتدا افزايش فعاليت هيدرولازي TTL تا رسيدن به يک غلظت بهينه را ميتوان ديد و غلظتهاي بالاتر از آن سبب کاهش فعاليت آنزيمي شدهاند. هرچند در رابطه با مايع يوني [C12MIM][Br] تنها اثر کاهشي بر فعاليت آنزيم ديده شد. بيشترين اثر افزايشي در فعاليت هيدرولازي TTL را ميتوان به ترتيب در رابطه با مايعات يوني [C4MIM][Br]، [C2MIM][Br]، [C6MIM][Br] ديد. بيشترين فعاليت نسبي آنها به ترتيب 254%، 177% و 135% بود که به ترتيب در غلظتهاي 1000، 300 و 300 ميلي مولار از مايع يوني به دست آمدند.

شکل 4-5- اثر غلظتهاي مختلف مايعات يوني بر فعاليت آنزيمي

4-5- اثر مايعات يوني بر پايداري دمايي آنزيم TTL
4-5-1- پايداري دمايي TTL در عدم حضور مايعات يوني
با توجه به نمودار پايداري دمايي (شکل 4-6) آنزيم TTL در محيط بافري در دماي 75 درجه سانتيگراد پس از گذشت يک ساعت همچنان 90 درصد از فعاليت خود را حفظ ميکند. اما در دماي 80 درجه سانتيگراد آنزيم با گذشت زمان به مرور پايداري خود را از دست ميدهد. پس از گذشت يک ساعت حرارتدهي در دماي 80 درجه سانتيگراد 39 درصد از فعاليت باقي خواهد ماند. در دماهاي بالاتر از 80، دماي 82 و °C 85، آنزيم کاملا ناپايدار بوده و پس از گذشت 15 دقيقه از حرارتدهي هيچ فعاليتي مشاهده نشد.

شکل 4-6- نمودار پايداري آنزيم TTL در دماهاي بالا در بافر تريس mM 50 ، 8?pH.

4-5-2- پايداري دمايي آنزيم TTL در حضور مايعات يوني
4-5-2-1- بررسي پايداري TTL در [C4MIM][Br] و ] [C4MIM][PF6 در دماهاي مختلف
بررسي پايداري دمايي در مخلوط آبي [C4MIM][Br] با غلظت 1 مولار، در دماي °C 90 افت شديدتري در پايداري آنزيم نسبت به دماي °C 85 را نشان ميدهد. همانطور که در نمودار پايداري دمايي (شکل 4-7) ميتوان ديد، در دماي °C 85، در محيط [C4MIM][Br]، بيش از 90 درصد از فعاليت آنزيمي تا 30 دقيقه حفظ شده است و بعد از گذشت يک ساعت از حرارتدهي همچنان بيش از 60 درصد از فعاليت آنزيمي باقي ميماند. آنزيم TTL در محيط [C4MIM][Br] در دماي °C 90، پس از گذشت 1 ساعت، 45 درصد از فعاليت خود را حفظ ميکند. نتايج نشان ميدهد که پايداري دمايي آنزيم در محيط [C4MIM][PF6] به شدت افزايش يافته است. آنزيم TTL در محيط [C4MIM][PF6] پس از 45 دقيقه حرارتدهي در دماي °C 85، همچنان 96 درصد از پايداري خود را حفظ کرده است. با افزايش دما به °C 90 توانايي مايع يوني [C4MIM][PF6] در حفظ پايداري آنزيم به همان شدت قبل است. همانطور که در نمودار B از شکل 4-7 مشاهده ميشود، آنزيم TTL در مايع يوني [C4MIM][PF6] پس از گذشت 90 دقيقه حرارتدهي در °C 90 و °C 85، همچنان 72 درصد از فعاليت اوليه خود را حفظ ميکند.

شکل4-7- نمودار پايداري TTL در [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] در دماهاي °C 85 و °C 90.
الف) محيط [C4MIM][Br] ب) محيط [C4MIM][PF6].

4-5-2-2- مقايسه اثر نوع آنيون مايعات يوني بر پايداري دمايي
مايعات يوني ايميدازوليومي بسته به نوع آنيوني که در ساختار خود دارند، شدت اثر پايدارکنندگي متفاوتي را از خود نشان ميدهند. براي مثال در مقايسهاي بين مايعات يوني [C4MIM][PF6] و [C4MIM][Br] در دماهاي بالا (°C85 و °C90) اثر پايدارکننده بيشتري در مورد مايع يوني داراي آنيون -PF6 ميتوان ديد (شکل4-8).در دماي °C85 ، 96 درصد از آنزيمها در محيط [C4MIM][PF6] پس از 45 دقيقه حرارت دهي پايدار ماندهاند و پس از آن شيب ملايمي از کاهش پايداري TTL مشاهده ميشود و پس از 90 دقيقه همچنان 70 درصد از آنزيمها پايداري خود را حفظ کردهاند. در حاليکه پايداري آنزيم در محيط [C4MIM][Br] طي حرارتدهي در °C85، با سرعت بيشتري کاهش يافت و در پايان 90 دقيقه حرارتدهي، 41 درصد از فعاليت اوليه آنزيمي مشاهده شد. با افزايش دما به °C 90 حفظ پايداري آنزيم در محيط [C4MIM][PF6] با همان روند قبل ديده ميشود، در حاليکه در محيط [C4MIM][Br] روند کاهشي شديدتري در پايداري آنزيم مشاهده ميشود. پس از 60 دقيقه حرارتدهي در °C 90 پايداري به 45 درصد ميزان اوليه رسيده است و پس از 90 دقيقه تنها 32 درصد از آنزيمها پايدار ماندهاند.

4-5-2-3- مقايسه اثر نوع کاتيون و طولهاي مختلف زنجيره کربني مايعات يوني بر پايداري دمايي آنزيم
پايداري دمايي آنزيم TTL در مايعات يوني ايميدازوليومي با طولهاي مختلف زنجيره کربني مورد بررسي قرار گرفت. همانطور که در شکل4-9 مشاهده ميشود مايعات يوني با زنجيرههاي 2، 4 و 6 کربنه عملکرد نسبتا مشابهي را در حفظ پايداري آنزيم از خود نشان ميدهند. در اين ميان [C6MIM][Br] با اختلاف کمي نسبت به [C2MIM][Br] و [C4MIM][Br]، محيط مناسبتري را براي حفظ پايداري آنزيم فراهم ميکند. در مورد اين 3 مايع يوني پس از گذشت 1 ساعت دمادهي در °C85 بيش از 50 درصد از فعاليت آنزيم همچنان باقي مانده است. همچنين مايعات يوني با زنجيره 12 کربنه هيچ گونه اثر مطلوبي بر پايداري آنزيم نشان نداده است.
همانطور که در شکل 4-10 نشان داده شده است، دو نوع مختلف کاتيون از پايه ايميدازوليوم و پايه پيريدينيوم تفاوت چنداني در ميزان پايداري آنزيم ايجاد نميکنند. اثر پايدارکننده مشابهي در مورد مايع يوني [C5Py][Br] و مايعات يوني [C4MIM][Br] و [C6MIM][Br] ديده شد. در رابظه با مايع يوني [C12Py][Br] نيز مانند [C12MIM][Br] هيچ اثر مطلوبي بر پايداري دمايي آنزيم مشاهده نشد.

شکل4-8- نمودار پايداري دمايي TTL در مايعات يوني؛ مقايسه اثر نوع آنيون.
A) دماي °C85 B) دماي °C90

شکل 4-9- نمودار مقايسه اثر مايعات يوني با طولهاي مختلف زنجيره کربني کاتيون ايميدازوليوم
بر پايداري دمايي آنزيم

شکل 4-10- نمودار بررسي اثر نوع کاتيون بر پايداري دمايي آنزيم TTL.

4-6- بررسي ساختار سوم آنزيم در حضور و عدم حضور مايعات يوني
در اين بخش از پژوهش ابتدا پايداري ساختاري آنزيم در بافر تريس در دماي °C 85 مورد بررسي قرار گرفت. شکل 4-11 طيف فلورسانس آنزيم TTL در بافر تريس mM 50 (pH = 8) را در زمانهاي مختلف حرارتدهي در °C 85 (0، 30 و 60 دقيقه) نشان ميدهد. بيشينه نشر فلورسانس در مورد آنزيم TTL قبل از حرارتدهي 570 و در ?Max 333 نانومتر است. پس از حرارتدهي شدت نشر فلورسانس به شدت کاهش يافته، به طوري که در زمان 30 دقيقه بيشينه نشر به 385 ودر زمان 60 دقيقه به 368 کاهش يافته است.

شکل 4-11- طيف فلورسانس آنزيم TTL در بافر تريس mM 50 پس از حرارتدهي در °C 85

به منظور بررسي پايداري دمايي ساختار آنزيم درمحيط مايعات يوني ايميدازوليومي با آنيون -PF6 در غلظت 100 % ، در دماي °C 85، به مدت 1 ساعت انکوبه گرديد. در مقايسه بين دو طول مختلف زنجيره آلکيلي کاتيون، مايع يوني [C4MIM][PF6] با شدت نشر فلورسانس بيشتر نسبت به [C6MIM][PF6]، اثر پايدارکنندگي بيشتري را از خود نشان داد. در شکل 4- 12 مشاهده ميشود که شدت نشر فلورسانس پس از 1 ساعت حرارتدهي به آنزيم در دماي °C 85، در محيط [C4MIM][PF6] در سطح 616 و در مورد [C6MIM][PF6] در سطح 332 قرار گرفته است. همچنين کاهش ?Max در محيط [C6MIM][PF6] به ميزان nm 5 ديده شد.
با بررسي طيف فلورسانس مربوط به TTL تيمار شده در مايع يوني [C4MIM][PF6] مقداري کاهش شدت نشر پس از 30 و 60 دقيقه دمادهي در °C85 ميتوان ديد (شکل 4-13). با اين وجود تفاوت زيادي در نشر فلورسانس بين نمونههاي حرارت ديده در مايع يوني و نمونه آنزيم غيرفعال وجود دارد که اين امر گوياي حفظ درصد بالايي از ساختار آنزيم در محيط [C4MIM][PF6] است.

شکل 4-12- طيفهاي فلورسانس مربوط به آنزيم TTL انکوبه شده در مايعات يوني ايميدازوليومي با آنيون PF6؛
پس از 60 دقيقه حرارتدهي در دماي°C 85

شکل 4-13- طيف فلورسانس آنزيم TTL انکوبه شده در مايع يوني [C4MIM][PF6]؛
پس از حرارتدهي در دماي°C 85.

فصل پنجم

بحث

5-1- اثر مايعات يوني بر فعاليت هيدرولازي آنزيم TTL

با به کارگيري مايعات يوني بر پايه ايميدازوليوم در فرآيندهاي بيوکاتاليزوري ميتوان فعاليت، اختصاصيت و پايداري آنزيمها را ارتقا داد (Wehofsky et al.,2008، Debnath et al.,2010). مايعات يوني ايميدازوليومي با آنيون برميد حلاليت خوبي در آب دارند. کارهاي متعددي در زمينه بررسي اثر مايعات يوني مختلف بر فعاليت آنزيم ليپاز در انجام واکنشهاي استريفيکاسيون، ترانس استريفيکاسيون و تفکيک مخلوطهاي راسميک انجام شده است(Liu et al.,2010 ،Kaar et al., 2003 ،Lozano et al., 2004 ، Vidya and Chadha, 2009 ،Habulin and Knez,2009 ). با اين وجود گزارشات محدودي از بررسي اثر مايعات يوني بر ميزان فعاليت هيدرولازي آنزيم ليپاز وجود دارد (Ventura et al., 2012 ، Na et al.,2013 ).
ميتوان اثر غلظتهاي مختلف و ساختار کاتيون مايع يوني بر فعاليت هيدرولازي TTL را بر اساس خصوصيات تفکيک يوني و تجمع مايعات يوني تفسير کرد. با توجه به گزارش Na و همکاران با افزايش غلظت مايعات يوني [CnMIM][Br] رسانايي محلول نيز افزايش مييابد (Na et al.,2013). به گزارش Sirieix-Plenet و

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید