مخلوطهاي آبي سازگاري بسيار خوبي دارند، در حالت بدون آب آنزيم بسيار مقاوم CALB را غير فعال ميکنند. بر اساس اطلاعات فعلي، مايعات يوني با آنيونهاي BF4- و PF6-، و آنيون مقاوم به هيدروليز NTf2- و آنيونهاي زنجير متوسط آلکيل سولفات به همراه کاتيونهاي ديآلکيلايميدازوليوم و آلکيلپيريدينيوم گزينههاي ايمنتري به نظر ميرسند (Van Rantwijk and Sheldon 2007).
تاکنون يک اساس نظري براي پيشبيني سازگاري آنزيمها و مايعات يوني بيآب ايجاد نشده است. هرچند تعدادي از عوامل سهيم احتمالي مانند قابليت کاتيون براي ايجاد پيوند هيدروژني (Park and Kazlauskas, 2001)، log P (Kaar et al., 2003)، تشکيل نانوساختارهاي متصل به هيدروژن، و گرانروي حلال (Lozano et al., 2005) مورد بحث قرار گرفتهاند. براساس شواهد موجود به نظر ميرسد که ميزان هسته دوستي آنيون (Kaar et al., 2003) يا قابليت پذيرش پيوند هيدروژني توسط آن (Sheldon et al., 2002) نيز، حداقل در حالتي که ميل کاتيون براي تشکيل پيوند هيدروژني کم است، ميتواند يکي از عوامل کنترل کننده باشد. در اين مورد يک استثناء وجود دارد و آن در مورد آنيون H2PO4-30 است که بدون دناتوره کردن ميتواند Cyt C31 را در خود به صورت کامل حل کند (Fujita et al. 2005). استثناء ديگر [HOPMIM]32[glycolate] است که با داشتن کاتيون و آنيوني با قابليت بالا در ايجاد پيوند هيدروژني، آنزيمهاي احياکننده را در فرم فعال در خود حل ميکند (Walker and Bruce, 2004).

شکل 1-3- آنزيم CALB در حضور مايعات يوني بدون آب. الف) شکل شماتيک از نحوه برهمکنش مايع يوني با بخشهاي باردار و غيرقطبي آنزيم، ب) ساختار شبيه سازي شده آنزيم CALB در محيط مايع يوني DCGUA-NO3؛
رنگ زرد مناطقي از سطح آنزيم را نشان ميدهد که زنجيرههاي آليفاتيک حضور دارند و رنگ نارنجي نشان دهنده مناطق باردار سطح آنزيم هستند (Klahn et al., 2011).

1-5-3- پايداري آنزيمها در مايعات يوني تقريبا بيآب
پايداري (دمايي) آنزيمها (فعاليت در طي زمان) معمولا در محيطهاي آلي به خصوص با فعاليت آبي کم، نسبت به محيطهاي آبي، بهتر است (Zaks and klibanov, 1984). مايعات يوني نيز ميتوانند چنين اثري داشته باشند. پايداري آنزيمي تعريف واضحي ندارد و روشهاي متنوعي براي سنجش آن وجود دارد. براي بررسي پايداري در ذخيره سازي، آنزيم در مايع يوني در يک دماي خاص انکوبه شده و ميزان فعاليت باقيمانده در نمونهها که با آب رقيق شدهاند بررسي ميشود. بازيابي فعاليت بالايي از آنزيم در چنين روشي نشان دهنده اين است که تغييرات ايجاد شده در ساختار آنزيم در اين چنين محيط ذخيرهسازي برگشت پذير است. پايداري آنزيم را ميتوان با انکوبه کردن آنزيم در مايع يوني در بازههاي زماني مختلف و سنجش فعاليت در همان محيط بررسي نمود. همچنين ميتوان ساختار آنزيم را با روشهاي اسپکتروسکوپي در محيط مورد نظر بررسي نمود. براي مثال دماي بازشدن ساختار پروتئين شيرين مونولين از C° 40 در آب به C° 105 در [C4MPr][NTf2] افزايش يافت (Baker et al., 2004). نوع ديگر پايداري که ميتوان مورد بررسي قرار داد پايداري در شرايط واکنش است.
بهطور کلي آنزيمها در مايعات يوني فعاليت و ساختار خود را در مدت زمان طولانيتر و در دماهاي بالاتري نسبت به حلالهاي آلي ملکولي حفظ ميکنند. دليل احتمالي اين امر گرانروي بالاي مايعات يوني است که باعث کند شدن حرکت دمينهاي پروتئين از موقعيت خود در فرم فعال پروتئين به موقعيتهاي جديد ايجاد کننده فرم غيرفعال ميشود (Van Rantwijk and Sheldon, 2007).

1-5-4- آنزيمها، مايعات يوني، پيوندهاي هيدروژني و فعاليت
پيوندهاي هيدروژني عامل پيوستگي ساختار آنزيمهاي آبپوشي شده و بدون آب هستند. هر تغيير ساختاري مستلزم فروپاشي تعداد قابل توجهي از پيوندهاي هيدروژني به طور همزمان ميباشد؛ اين امر سهم قابل توجهي در پايداري آنزيم دارد و گوياي اثرات حافظه آبپوشي 33و اثرات پسماند34 است (Halling, 2004). منظور از اثرات پسماند اين است که تعداد ملکولهاي آب متصل به آنزيم تنها وابسته به ميزان فعاليت آبي نيست، بلکه به حافظه آبپوشي نيز مربوط ميباشد.
پژوهشهاي مختلفي نشان داده اند حلالهايي که در شرايط آبي يا غيرآبي با آنزيم سازگارند، مانند استونيتريل يا ترت- بوتيل الکل، در غلظتهاي پايين باعث غيرفعال شدن آنزيم ميشوند (Griebenow et al., 1996). چنين نتايجي را ميتوان در پژوهشهاي انجام شده در مايعات يوني نيز مشاهده کرد. دليل اين امر کاهش اثر آبگريزي در حضور حلال است. در نتيجه پايداري آنزيم کاهش مييابد تا اينکه در يک غلظت مشخص آنزيم غيرفعال ميشود.
پيوندهاي هيدروژني ميتوانند توضيح مناسبي براي پايداري آنزيم در مايعات يوني بدون آب باشند. مايعات يوني، بهخصوص آنيون آنها که پيوندهاي هيدروژني قوي ايجاد ميکنند، ممکن است باعث از بين رفتن پيوندهاي هيدروژني شوند که عامل يکپارچگي ساختار ?- هليکسها و صفحات ? بودهاند و بنابراين باعث باز شدن کل پروتئين يا بخشي از آن شوند. براي مثال يون لاکتات به راحتي ميتواند با اسکلت پليپپتيدي پيوند هيدروژني برقرار کند. اندازه يون نيز ميتواند مهم باشد زيرا يونهاي با اندازه بزرگ براي ايجاد تعداد اندکي پيوند هيدروژني بين خود و آنزيم، نياز دارند که تعداد زيادي پيوند هيدروژني را بشکنند، بنابراين نميتوانند به سادگي پايداري آنزيم را مختل کنند. در آنزيمهايي که به صورت برگشتپذير غيرفعال شدهاند احتمالا پيوندهاي هيدروژني توانستهاند کانفورماسيون را حفظ کنند و در ادامه براي بازيابي ساختار آنزيم لازم است اين پيوندها فروپاشند و پيوندهاي طبيعي دوباره ايجاد شوند. رقيق کردن عوامل دناتوره کننده، مانند مايع يوني دناتوره کننده، ميتواند باعث تشکيل دوباره پيوندها شود احتمالا چنين ترکيباتي که پيوند هيدروژني قوي تشکيل ميدهند با تشکيل پيوندهاي هيدروژني ناپايدار، تشکيل دوباره پيوندها را تسهيل ميکنند.

1-5-5- بيوترانسفورماسيون در محيط مايعات يوني توسط ليپازها و استرازها
کاربرد ليپازها در بيوترانسفورماسيون شامل طيف وسيعي از واکنشهاي سالوولايتيک35( نوعي از واکنشهاي جانشيني هستند که در آنها حلال به عنوان نوکلئوفيل عمل کرده و جانشين يک اتم يا گروه در ملکول سوبسترا ميشود) مربوط به گروه کربوکسيل است (McNaught and Wilkinson, 1997). از جمله اين واکنشها ميتوان استريفيکاسيون36، ترانساستريفيکاسيون (الکلوليز37)، پرهيدروليز38، و آمينوليز39 (سنتز آميد) را نام برد (Schmidt and Verger, 1998). واکنشهاي ترانساستريفيکاسيون و سنتز آميد ترجيحا در محيط بيآب و در حضور زئوليت فعال40، جهت متوقف ساختن واکنشهاي هيدرولازي ناخواسته، انجام ميشود. در اين واکنشها اغلب از آنزيمهايي همچون CALB (Anderson et al., 1998, Kirk and Christensen, 2002)، PSL و PCL استفاده ميشود (Bornscheuer and Kazlauskas, 1999) که به راحتي چنين شرايطي را تحمل ميکنند.
جهت دستيابي به بهينهترين حالت تشخيص انانتيومرها لازم است که محيط واکنش، مايع يوني يا محيطهاي سنتي، با توجه به نوع ماده واکنش دهنده و نوع آنزيم بهينهسازي شود. در واقع نميتوان يک مايع يوني را به عنوان بهترين گزينه براي انجام واکنشهاي تفکيک مخلوطهاي راسميک نام برد، همانطور که يک حلال آلي را نميتوان به طور کلي بهترين دانست. با ظهور مايعات يوني، گزينههاي حلال انتخابي و بنابراين شانس يافتن محيط مناسب به ميزان زيادي افزايش يافته است.

1-6- بررسي ساختار پروتئين به روش اسپکتروسکوپي فلورسانس41
ملکول پروتئين طي فرآيندهاي غيرفعال شدن چند فاز مختلف را طي ميکند. اين پديده نشاندهنده يک سري وقايع درون ملکولي در کنفورماسيونهاي گذراي پروتئين است (De Diego et al., 2004). از روشهاي مختلفي جهت بررسي ساختار پروتئين استفاده ميشود که از آن جمله ميتوان روشهاي 42DSC ، 43NMR، CD44، FTIR45، اسپکتروفتومتري 46UV، کريستالوگرافي اشعه 47X و اسپکتروسکوپي فلورسانس را نام برد. فلورسانس يک روش در دسترس است که ميتوان از آن جهت بررسي ساختار سوم پروتئين استفاده کرد.
در پروتئينهايي که داراي آمينواسيدهاي فلوروفور48 هستند (مثل تريپتوفان، تيروزين يا فنيلآلانين) تغيير در 49IMax فلورسانس و شيفت قرمز50 در 51?Max فرآيند دناتوره شدن پروتئين را نشان ميدهند و هر دوي اين تغييرات به دليل افزايش قطبيت باقيماندههاي تريپتوفان پروتئين با قرارگيري آن در معرض حلال است. مکانيسم ملکولي پايدار شدن آنزيم در مايعات يوني (در بيوکاتاليز کاربردي) همچنان نامعلوم است و نياز به بررسيهاي بيشتر وجود دارد (De Diego et al., 2004).
پروتئينها پس از برانگيختگي در طول موج nm 280 (مربوط به همگي فلوروفورهاي پروتئين) يا nm 295 (بيشتر مربوط به باقيماندههاي تريپتوفان)، به طور معمول نور را بين طول موج nm 300 و nm 350 منتشر ميکنند. شدت فلورسانس در واقع جمع نور منتشر شده توسط هر کدام از باقيماندههاي فلوروفور پروتئين ميباشد. باز شدن نسبي ساختار پروتئين باعث افزايش برهمکنش باقيماندههاي آمينواسيدي پروتئين با حلال (به طور معمول آب) ميشود. همچنين ممکن است حلقه اندولي تريپتوفان با ديگر آمينواسيدهاي موجود در ساختار پروتئين وارد برهمکنش شود. هر دوي اين پديدهها سبب کاهش شدت فلورسانس و گاهي سبب ايجاد يک شيفت قرمز در پيک نشر فلورسانس (کاهش ?Max) ميشود که اين پديده را نشانهاي از باز شدن پروتئين در محيط آبي ميدانند (Bekhouche et al., 2011).
با ورود مايعات يوني به محيط پروتئينها به عنوان حلالهاي جديد، مشکلاتي در بررسي ساختار توسط روشهاي مختلف ايجاد ميشود. از جمله اين مشکلات تداخلهاي ايجاد شده در طيفهاي CD و فلورسانس را ميتوان نام برد که در گزارشات مختلفي به آنها اشاره شده است (Shu et al., 2011, Bekhouche et al., 2011, Attri and Venkatesu, 2013). با اين وجود شايد بتوان ساختار پروتئين را بيشتر بر اساس شيفتهاي ?Max و مقايسه شدت فلورسانس در حالتهاي دمادهي مختلف در يک مايع يوني با غلظت مشخص، مورد بررسي قرار داد.
به طور کلي ميتوان گفت که طيف وسيعي از آنزيمها ميتوانند مخلوطهاي آبي مايعات يوني را به عنوان محيط واکنش تحمل کنند. به سختي ميتوان مايع يوني را يافت که هيچ آنزيمي نتواند با آن سازگار باشد. عقيده بر اين است که مايعات يوني در غلظتهاي بالاتري، نسبت به حلالهاي ملکولي قابل امتزاج با آب، ميتوانند توسط آنزيمها تحمل شوند.
بسياري از هيدرولازها به خصوص آنهايي که توانايي تحمل حلالهاي ملکولي را دارند به ميزان قابل توجهي ميتوانند واکنشهاي غيرهيدرولازي را در مايعات يوني کاتاليز کنند. ميزان فعاليت آنزيمها در مايعات يوني در حد فعاليت آنها در حلالهاي آلي و يا حتي بالاتر نيز ميباشد. به علاوه در بسياري از موارد افزايش پايداري دمايي و عملکردي و افزايش اختصاصيت انانتيو و ريجيو نيز ديده شده است.
مايعات يوني سازگار با آنزيمها به طور معمول برهمکنش قوي با آنزيم نميدهند و باعث حل شدن آنزيم نميشوند. تاکنون اساس نظري براي پيشبيني سازگار بودن يا نبودن مايع يوني با آنزيم ايجاد نشده است هرچند با توجه به علاقه زيادي که در اين موضوع وجود دارد انتظار ميرود که به زودي يک اساس نظري در اين زمينه مطرح گردد.
مايعات يوني قابليت بالايي در کاربرد به عنوان حلال در واکنشهاي بيوترانسفورماسيون مربوط به واکنشدهندههاي بسيار قطبي مانند پليساکاريدها دارند؛ زيرا چنين واکنشهايي به دليل محدوديتهاي تعادل واکنش در آب قابل انجام نيستند. چنين جايگزيني يک محيط فرار با محيط غيرفرار مايعات يوني بدون شک ادامه خواهد يافت و به تدريج توسط صنايع شيميايي پذيرفته خواهد شد و سهم بزرگي در ايجاد

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید