غلظتهاي مختلف مايعات يوني بر فعاليت هيدرولازي آنزيم TTL
بررسي اثر مايعات يوني با کاتيون و آنيونهاي مختلف بر پايداري دمايي آنزيم TTL
مطالعه پايداري دمايي بر اساس تغيير در ساختار سوم آنزيم TTL در حضور و عدم حضور مايعات يوني

فرضيه
با استفاده از مايع يوني مناسب به عنوان محيط واکنش ميتوان به پايداري بيشتر و فعاليت بهتري از آنزيم دست يافت.

فصل سوم

مواد و روشها

3-1- ابزار
انواع ظروف و لوازم آزمايشگاهي (ارلن، بشر، پليت، بورت، کندانسور و غيره)
سمپلر
ترازو حساس (MettlerToledo)
کيسه دياليز
استيرر (Vision)
pH سنج (Metrohm)
هات بلاک (پديده نوژن پارس)
بن ماري (ريحان طب)
آون خلاء
سيستم تغليظ پروتئين و فيلتر مربوطه (Amicon)
هود لامينار (ژال تجهيز)
انکوباتور (ريحان طب)
شيکر انکوباتور (Vision)
سانتريفوژ (Sigma 16-P)
سانيکاتور (Bandelin Sonicator)
اسپکتروفتومتر UV-Visible (Shimadzu)
اسپکتروفتومتر فلورسانس (Perkin Elmer LS 45)
اتوکلاو (ريحان طب)
پمپ پريستالتيک (Longer Pump BT100-2J)
دستگاه Power(Paya Pajoohesh)

3-2- مواد
3-2-1- مواد لازم جهت تهيه مايعات يوني
آلکيل هاليد ها (برومواتان، بروموبوتان، بروموهگزان، برومودودکان) (Merck)
متيل ايميدازوليوم (Merck)
آمونيوم هگزافلوروفسفات (Acros Organics)
دي اتيل اتر (Panreac)

3-2-2- مواد لازم جهت تهيه آنزيم ليپاز درون سلولي TTL
3-2-2-1- سوش باکتري
باکتريxL1blue E.coli (جهت تکثير پلازميد حاوي ژن ليپاز)
باکتري E.coli BL21 (جهت بيان پروتئين)
3-2-2-2- مواد مورد نياز براي ترانسفورماسيون
پلازميد حاوي ژن ليپاز درون سلولي TTL (pQE-TTL)
KCM (KCl, CaCl2, MgCl2)
آب مقطر استريل
3-2-2-3- مواد مورد نياز براي کشت باکتري و استخراج عصاره سلولي
تريپتون، عصاره مخمر، نمک سديم کلريد (Merck) (جهت تهيه محيط LB (Louria Bertoni))
آگار (Merck)
آنتي بيوتيک آمپي سيلين
ايزوپروپيل ?-D- تيوگالاکتوزيد (IPTG) (سيناژن)
آنزيم ليزوزيم (CinnaGen)
بافر تريس (Merck)
سديم فسفات (Merck)
3-2-2-4- مواد مورد نياز براي تخليص آنزيم ليپاز
رزين Q- Sepharose
رزين Gel filtration

3-2-2-5- مواد مورد نياز براي سنجش کمي ميزان پروتئين و ژل SDS PAGE
رنگ کوماسي بلو G-250 و R-250
فسفريک اسيد و استيک اسيد گلاسيال (Merck)
اتانول و متانول مطلق (Merck)
آکريل آميد و بيس آکريل آميد (Merck)
TEMED(N,N,N,N’-tetramethylenediamine)
سديم دو دسيل سولفات (SDS) (Merck)
آمونيوم پرسولفات (APS)
2- مرکاپتواتانول
بروموفنول بلو
آلبومين سرم گاو (BSA)
بافر تريس و گلايسين (Merck)

3-2-3- مواد مورد نياز براي سنجش فعاليت آنزيمي ليپاز
سوبستراي پارانيتروفنيل پالميتات (Sigma)
استونيتريل (Merck)
بافر تريس (Merck)

3-2-4- نرم افزارها
نرم افزار Excel 2010(جهت رسم نمودارها)
نرم افزار Sigma Plot (جهت رسم طيف هاي فلورسانس)

3-3- روشها
3-3-1- روش تهيه مايعات يوني
3-3-1-1- روش تهيه مايعات يوني با آنيون برميد
در اين پژوهش جهت تهيه مايعات يوني از ميزان مول برابر از آلکيل هاليد و متيل ايميدازوليوم استفاده شد. در اين روش متيل ايميدازوليوم قطره قطره در فواصل زماني مساوي به آلکيل هاليد که در حال بهم خوردن شديد بود اضافه شد و محلول نهايي در حال بهم خوردن شديد به مدت 24 ساعت در دماي °C 50 رفلاکس شد (شکل3-1). در مرحله بعد محلول بدست آمده با دي اتيل اتر شستشو داده شد تا مواد آلي واکنشگر باقيمانده حذف شود. مرحله شستشو 10 تا 15 بار انجام شد. پس از هر بار افزودن دي اتيل اتر به مايع يوني و بهم زدن شديد آن، محلول در حال سکون قرار داده شد تا دو فاز مايع يوني و دي اتيل اتر از هم جدا شوند. سپس مايع يوني شسته شده به مدت 24 ساعت در آون°C 50 گذاشته شد تا دي اتيل اتر آن کاملا تبخير شود.

شکل 3-1- سنتز مايعات يوني با آنيون برميد

3-3-1-2- روش تهيه مايعات يوني با آنيون هگزافلوروفسفات
در اين مرحله ميزان مول مساوي از نمک آمونيوم هگزافلوروفسفات در مقداري آب حل شد و سپس محلول نمک آمونيوم هگزافلوروفسفات به کمک بورت قطره قطره به محلول آبي مايع يوني داراي آنيون بروميد در حال بهم خوردن شديد اضافه گرديد. سپس به مدت 24 ساعت در دماي اتاق محلول روي استيرر بهم خورد تا واکنش جايگزيني آنيون به خوبي انجام شود. در مرحله بعد شستشوي مايع يوني جديد با آب جهت جداسازي آنيون بروميد انجام شد و تست برم دار بودن به کمک نيترات نقره نبود يون برميد را در مايع يوني PF6- دار تاييد کرد. سپس مايع يوني PF6- دار بدست آمده به مدت 24 ساعت براي حذف آب موجود در محيط در آون خلاء در دماي °C 70 قرار داده شد. مايع يوني ساخته شده در ظرف درب دار نگهداري شد.

3-3-2- روش کشت باکتري و بيان القايي پروتئين نو ترکيب
3-3-2-1- محيط کشت باکتري E. coli
در اين پژوهش از محيط کشت Luria Bertani (LB) براي رشد سويههاي اشرشياکلي به صورت مايع و جامد (حاوي آگار) استفاده گرديد. همچنين در محيط کشت سوشهاي حامل ساختار پلاسميد از آنتيبيوتيک آمپيسيلين با غلظت نهايي µg/ml 100 استفاده شد. جدول 3-1 نشان دهنده ترکيبات محيط کشت Luria Bertani است. شايان ذکر است که آنتي بيوتيک پس از استريل شدن محيط کشت توسط اتوکلاو و رسيدن دماي محيط کشت به حدود C° 50 اضافه ميگردد.

جدول 3-1- محيط کشت Luria Bertani
ترکيب
غلظت
عصاره مخمر
5/0 درصد
تريپتون
1 درصد
NaCl
1 درصد
آگار (محيط کشت جامد)
2 درصد

3-3-2-2- انتقال DNA خارجي به باکتري E.coli
3-3-2-2-1- تهيه سلول هاي مستعد به روش شيميايي:
به منظور تهيه سلولهاي مستعد براي عمل ترانسفورماسيون (انتقال پلاسميد به داخل سلول)، ابتدا يک کشت خطي از سلولهاي ذخيره شده مورد نظر در ازت مايع بر روي پليت LB تهيه و يک شب در گرمخانه C? 37 قرار داده ميشود. سپس يک کلني از روي پليت برداشته و در شرايط استريل به 25 ميلي ليتر محيط کشت مايع LB افزوده و به مدت 4 الي 6 ساعت در دماي c?37 با حرکت دوراني rpm180رشد داده ميشود تا تراکم سلولها در محيط کشت به جذبي ما بين 4/0 تا 6/0 در طول موج 600 نانومتر برسد. سلولها را در دماي ?C 4 به مدت 10 دقيقه در g4000 سانتريفوژ کرده و آنها را در5/2 ميليليتر محيط خاص مناسب براي تهيه ي اين نوع سلولها به نام محيط TSB که طبق جدول3-2 تهيه گرديد، به صورت معلق در ميآوريم. لازم به ذکر است که در اين حالت غلظت سلولي به ميزان 10 برابر افزايش داده ميشود. سپس سلولهاي معلق شده را به مدت 10 الي 60 دقيقه (بسته به نوع سلول E.coli مورد استفاده) برروي يخ قرار ميدهيم. محصول سلولي حاصل را در مقادير 200-100 ميکروليتري در لولههاي اپندروف استريل تقسيم کرده و بلافاصله در ازت مايع قرار ميدهيم. اين سلولها را ميتوان در فريزر c?80- نگهداري کرد و به عنوان سلول مستعد به مدت حداقل شش الي دوازده ماه مورد استفاده قرار داد. لازم به ذکر است که از هر لوله تنها يک بار ميتوان به عنوان سلول مستعد استفاده کرد.

3-3-2-2-2- انتقال پلاسميد به سلول مستعد :
بين 1 تا 10 ميکروليتر بسته به غلظت محلولDNA موجود (معادل 1-1/0 ميکروگرم) پلاسميد، در شرايط استريل در يک لوله اپندروف ريخته وبه آن پنج ميکروليتر از بافر KCM 5X که طبق جدول3-3 تهيه گرديد، افزوده و با آب مقطر استريل به حجم lµ25 ميرسانيم. مخلوط در يخ نگهداري ميشود. حال سلول مستعد را از فريزر ?C80- خارج و اجازه ميدهيم تا ذوب شود . 25 ميکروليتر از سلول مستعد را به محلول حاوي پلاسميد افزوده و به مدت 15 الي 20 دقيقه در دماي ?C4 قرار ميدهيم. سپس در دماي ?C 42 به مدت 105 ثانيه گرمادهي شده که در اين مرحله، ملکولهاي DNA بر روي سطح سلول ها رونشيني شده و به درون سلول منتقل خواهند شد . بلافاصله سلولها را به درون يخ منتقل کرده و به آنها 100 ميکروليتر محيط LB سرد استريل و بدون آنتيبيوتيک،اضافه و به مدت يک ساعت در دماي C?37 و حرکت دوراني مناسب قرار ميدهيم. در نهايت 150 ميکروليتر محيط حاصل را بر روي پليت حاوي محيط کشت انتخابي برده و با استفاده از لوپ شيشهاي استريل به آرامي بر روي تمامي سطح پليت بطور کامل و يکنواخت پخش ميگردد . پس از جذب سلولها بر روي سطح پليت، پليتها به صورت وارونه در گرمخانه c?37 به مدت 16 ساعت قرار داده ميشوند.
لازم به ذکر است که اين پليتها، حاوي آنتيبيوتيک خاصي است که ژن مقاومت مربوطه بر روي پلاسميد مورد نظر وجود دارد و در نتيجه تنها سلولهايي که حاوي پلاسميد نوترکيب هستند قادر به رشد بر روي محيط انتخابي هستند.

جدول 3-2- نحوه تهيه محلول TSB
ترکيبات مورد نياز
مقدار
Luria Bertani
75 (ml) 2X
DMSO
5/7 (ml)
PEG 400
3/13 (ml)
MgSo4
5/1 (ml)
MgCl2
5/1 (ml)
ddH2O
3/51 (ml)
Total valume
150 (ml)

جدول 3-3- نحوه تهيه محلول KCM
غلظت مناسب براي تهيه محلول 5X
ترکيبات مورد استفاده
(M) 5/0
KCl
(M) 15/0
CaCl2
(M) 25/0
MgCl2

3-3-2-3- روش تهيه استوک84 باکتري
براي تهيه استوک از باکتريهاي حاوي ساختار پلاسميد، ابتدا از باکتري مورد نظر کشت يک شبه85 گذاشته شد. سلولها به کمک سانتريفوژ رسوب داده شدند و سوپ رويي دور ريخته شد. سپس به نسبت 1:1 گليسرول استريل 50% به محيط کشت LB اضافه شد. آنگاه رسوب سلولها در 1/5 حجم اوليه محيط کشت، از اين محلول حل شدند. در آخر آمپيسيلين با غلظت نهايي ?g/ml 100 به سلولها اضافه شد و در C°20- ذخيره گرديد.
3-3-2-4- کشت باکتري و القاي بيان آنزيم نوترکيب
کلني مورد نظر از بين باکتريهاي ترانسفورم شده انتخاب شد و به محيط کشت LB داراي آنتي بيوتيک آمپيسيلين (?g/ml100) انتقال يافت. پس از رشد باکتري به مدت 16 ساعت در دماي °C 37، کشت 1 درصد تلقيح از نمونه باکتري رشد کرده، در حجم ml 20 محيط LB با آمپي سيلين ايجاد شد. پس از گذشت 4 ساعت از کشت اوليه باکتري ها در دماي °C 37، زماني که کدورت محيط در طول موج nm 600 به 9/0 رسيد، با افزودن IPTG (با غلظت نهايي mM 1) به محيط هاي کشت بيان پروتئين نوترکيب القا شد و با کاهش دماي انکوباتور به °C 30 شرايط براي توليد آنزيم نوترکيب توسط باکتريها فراهم شد. پس از گذشت 5 ساعت از زمان القا، سلول هاي باکتري به کمک سانتريفوژ به مدت 5 دقيقه با دور rpm 5000 رسوب داده شدند و در 1/10 حجم اوليه، در بافر تريس mM 50 دوباره حل شدند و به مدت 16 ساعت در °C 20- فريز شدند.

3-3-2-5- بهينه سازي بيان آنزيم نوترکيب
در اين بخش بهينهسازي بيان پروتئين نوترکيب ابتدا با انتخاب بهترين کلني از نظر بيان TTL بر اساس ميزان فعاليت آنزيمي عصاره سلولي و سپس بهينه سازي زمان پس از القا بر اساس روش SDS-PAGE انجام شد.

3-3-2-5- 1- انتخاب بهترين کلني از نظر بيان آنزيم TTL
ساختار پلاسميد حاوي ژن آنزيم TTL به روش گفته شده در بخش 3-3-2-2 به درون باکتري منتقل شد. سپس با ليز باکتريها پروتئينهاي درون سلول جدا شدند (بخش 3-3-2-5) و سنجش فعاليت آنزيمي در مورد هرکدام از نمونهها انجام شد (بر اساس روش ذکر شده در بخش 3-3-6). از بين 6 کلني ترانسفورم شده بر اساس ميزان توانايي توليد آنزيم 1 کلني انتخاب شد و به صورت غليظ شده در دماي°C 20- ذخيره گرديد و در مراحل بعد مورد استفاده قرار گرفت.

3-3-2-5-2- انتخاب بهترين زمان پس از القا
براي بهينه سازي بيان يک پروتئين نوترکيب پيشنهاد

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید