استفاده ميشد تا باندهاي پروتئيني به وضوح ديده شوند.
ژل در محلول آبي 7% اسيد استيک قرار داده شد که ژل در اين حالت براي مدتهاي طولاني قابل نگهداري است.

جدول 3-5- نحوه تهيه بافر نمونه 4X
ماده
مقدار
SDS
(mg) 750
تريس- HCl
(mg) 380
گليسرول
(ml) 5/2
برموفنول بلو
(mg) 5
2- مرکاپتواتانول
(ml) 5/2

جدول 3-6- نحوه تهيه ژل پلي اکريل آميد

درصد ژل
اجزاء ژل*

بافر
محلول استوک اکريل آميد
آب مقطر
SDS 20%
APS 10%
TEMED 100%
ژل تفکيک کننده
(ml 6)
5/12
ml 5/1
ml 44/2
ml 06/2
µl 30
µl 30
µl 20

15
ml 5/1
ml 3
ml 5/1
µl 30
µl 30
µl 20
ژل متراکم کننده
(ml 5)
5
ml 25/1
ml 8/0
ml 9/2
µl 30
µl 30
µl 20
* براي تهيه حجم V از ژل با درصد T مورد نظر، حجم Vs را طبق فرمول زير محاسبه و از محلول استوک اکريل آميد برميداريم و با V/4 از بافر ژل و آب مقطر به ميزان [V-(V/4 + Vs)] مخلوط ميکنيم. در اين پژوهش Ts معادل 8/30 % بود. Vs=VT/Ts

3-3-6- سنجش فعاليت آنزيمي با سوبستراي پارانيتروفنيل پالميتات92
اين روش سنجش، نوعي روش رنگ سنجي است که در آن ميزان جذب نوري محصول واکنش (پارانيتروفنول) که رنگ زرد دارد، در طول موج nm 410 مورد بررسي قرار مي گيرد. جهت سنجش فعاليت آنزيمي مخلوط بافر و سوبسترا مطابق مقادير جدول 3-7 تهيه گرديد و به مدت 5 دقيقه در دماي °C 65 انکوبه شد. سپس آنزيم ليپاز به مخلوط اضافه گرديد. مدت زمان انجام واکنش 5 دقيقه بوده و پس از اين زمان با قرار دادن مخلوط واکنش در يخ به مدت 1 دقيقه، فعاليت ليپاز متوقف گرديد. ميزان فعاليت آنزيمي در 1 دقيقه با کسر ميزان جذب نوري مخلوط واکنش بعد از 5 دقيقه از ميزان جذب نوري آن در زمان صفر و تقسيم عدد به دست آمده بر 5 بدست آمد. يک واحد آنزيمي، مقدار آنزيمي در نظر گرفته شد که مي تواند در 1 دقيقه، مقدار 1 ميکرومول p-نيتروفنول آزاد کند. تعداد واحد آنزيمي در واحد حجم بر اساس رابطه زير بدست آمد:
(Enzyme Unit)/ml=(?A/?t)/(?×l×V_Enzyme )×V_Total
1/15 = ? (ضريب خاموشي مولي TTL93)
l = 1cm : طول مسير عبور نور94
VEnzyme: حجم آنزيم در مخلوط واکنش بر حسب ميلي ليتر
VTotal: حجم نهايي مخلوط واکنش بر حسب ميلي ليتر

جدول 3-7- نحوه تهيه مخلوط سنجش فعاليت آنزيم
ترکيبات مورد نياز
حجم مورد استفاده بر حسب (?l)
سوبسترا پارانيتروفنيل پالميتات*
40
آنزيم
30
بافر تريس* با ترايتون 100-X
330
حجم نهايي
400
* غلظت سوبستراي pNPP : 10 ميلي مولار
* بافر تريس داراي غلظت 50 ميلي مولار بوده و ترايتون 100-X با غلظت نهايي 1% در بافر وجود دارد.

3-3-7- روش بررسي فعاليت آنزيمي در حضور غلظت هاي مختلف از انواع مايعات يوني
در اين بخش از پژوهش مخلوط بافر، سوبسترا و مايع يوني با غلظتهاي نهايي مختلفي از مايعات يوني (بين صفر تا 5/1 مولار) [C2MIM][Br]، [C4MIM][Br]، [C6MIM][Br]، [C12MIM][Br] ايجاد شد. با افزودن آنزيم ليپاز به مخلوط ايجاد شده، اثر حضور غلظت هاي مختلف مايع يوني بر فعاليت آنزيم ليپاز بر اساس روش سنجش گفته شده در بخش 3-3-5 مورد بررسي قرار گرفت. در ضمن براي بدست آوردن فعاليت خالص آنزيمي، ميزان هيدروليز pNPP در حضور غلظت هاي مختلف مايعات يوني از ميزان فعاليت بدست آمده کسر شد.

3-3-8- روش بررسي پايداري دمايي آنزيم TTL در دماهاي بالا
به منظور بررسي ميزان پايداري دمايي ليپاز TTL ، 0052/0 گرم پودر آنزيم ليوفيليز شده (داراي غلظت پروتئيني معادل mg/ml 307/0) به ?l 600 بافر تريس mM 50 اضافه شد. سپس با انجام ورتکس ملايم آنزيم در بافر حل شد. 4 محلول آنزيمي به همين روش ايجاد شد. محلولهاي به دست آمده در دماهاي°C 75 ، °C 80 ، °C 82 و °C 85 در لولههاي اپندورف 5/1 ميلي ليتري در دستگاه هات بلاک انکوبه گرديد. در زمانهاي 0، 15، 30، 45 و 60 دقيقه مقداري از هر کدام از نمونههاي انکوبه شده برداشته و به مدت 30 دقيقه در يخ قرار داده شد. با بررسي فعاليت آنزيمهاي انکوبه شده در دماها و زمانهاي مختلف پايداري دمايي آنزيم مورد بررسي قرار گرفت.

3-3-9- روش بررسي پايداري آنزيم ليپاز TTL در حضور مايعات يوني مختلف
در اين پژوهش به منظور بررسي ميزان پايداري ليپاز TTL در مايعات يوني، 0052/0 گرم پودر آنزيم ليوفيليز شده (داراي غلظت پروتئيني معادل mg/ml 307/0) به ?l 600 محلول آبي مايعات يوني (داراي آنيون برميد)، با غلظت M 1 ، و يا ?l 600 از مايعات يوني نامحلول در آب (داراي آنيون هگزافلوروفسفات) اضافه شد. سپس با انجام ورتکس ملايم آنزيم در مايع يوني محلول يا معلق گرديد. مخلوطهاي به دست آمده در دماهاي °C 85 و °C 90 در لولههاي اپندورف در دستگاه هات بلاک انکوبه گرديد. در زمانهاي 0، 15، 30، 45، 60 و 90 دقيقه مقداري از هر کدام از نمونههاي انکوبه شده برداشته و به مدت 30 دقيقه در يخ قرار داده شد. با بررسي فعاليت آنزيمهاي انکوبه شده در دماها، زمانها و مايعات يوني مختلف ميزان اثر مايع يوني بر پايداري دمايي آنزيم مورد بررسي قرار گرفت. فعاليتهاي خالص آنزيمي پس از حرارتدهي آنزيم در حضور مايعات يوني، با کسر فعاليتهاي به دست آمده از ميزان پايه هيدروليز pNPP توسط هرکدام از مايعات يوني داراي آنيون برميد، به دست آمد. پايداري دمايي يک نمونه کنترل از آنزيم در عدم حضور مايعات يوني (در بافر تريس mM 50) نيز به همين روش مورد بررسي قرار گرفت. لازم به ذکر است که در رابطه با مايعات يوني نامحلول در آب پس از اتمام زمان يخگذاري مخلوط مايع يوني حاوي آنزيم با حجم مساوي از بافر شسته شد و پس از سانتريفوژ ملايم محلول رويي حاوي آنزيم مورد سنجش فعاليت آنزيمي قرار گرفت.

3-3-10- روش بررسي ساختار سوم آنزيم TTL در حضور مايعات يوني
اسپکتروسکوپي فلورسانس ذاتي پروتئين در حضور و عدم حضور مايعات يوني مختلف، جهت درک بهتر فرآيند باز شدن ساختار پروتئين انجام شد. آنزيم TTL خالص با غلظت نهايي ?M 1/0 به مايعات يوني اضافه شد. مايعات يوني نامحلول در آب به صورت خالص استفاده شدند. مخلوط آنزيم با مايع يوني پس از ورتکس ملايم به صورت امولسيون در آمده و در لولههاي اپندورف درون چاهکهاي دستگاه هات بلاک در دماي °C 85 قرار گرفتند. مايعات يوني محلول در آب (داراي آنيون برميد) با غلظت نهايي 1 مولار (رقيقسازي با بافر تريس 50 ميلي مولار) مورد استفاده قرار گرفتند. يک نمونه کنترل از آنزيم در عدم حضور مايعات يوني نيز دمادهي شد و طيف فلورسانس مربوط به آن ثبت گرديد. در رابطه با مايعات يوني نامحلول در آب، براي جداسازي پروتئين از فضاي مايع يوني، با حفظ غلظت نهايي آنزيم در ?M 1/0، شستشو با بافر تريس 50 ميلي مولار انجام شد.
نمونههاي پروتئيني در nm 295 برانگيخته شدند و طيفهاي نشر فلورسانس بين nm 310 تا nm 500 ثبت گرديد. شکاف برانگيختگي و نشر فلورسانس هر دو nm 10 تنظيم شدند. پس از گذشت زمانهاي دمادهي مورد نظر (0، 30، 60 دقيقه) نمونهها در يخ سرد شدند تا در صورت برگشتپذير بودن دناتوراسيون پروتئينها به حالت طبيعي برگردند و سپس طيف فلورسانس آنها مورد بررسي قرار گرفت.

فصل چهارم

نتايج

4-1- بهينه سازي بيان آنزيم نوترکيب
آنزيم ليپاز مقاوم به دما (TTL) توسط باکتري ترموانروباکتر ترموهيدروسولفوريکوس نوعي آرکئاباکتر گرمادوست ترشح ميشود. اين باکتري از يک درياچه آب گرم در آلمان جداسازي شده است. ژن آنزيم TTL توسط رويتر از ژنوم باکتري جداسازي و وارد وکتور بياني PQE- 80L شد (Royter M., 2006) (شکل 4-1). وکتور حاوي ژن TTL هديهاي از طرف گروه تحقيقاتي در TUHH بود که در اين پژوهش به درون باکتري E.coli BL21 منتقل شد و بيان آن مورد بررسي قرار گرفت.

شکل 4-1- وکتور PQE-80L حاوي ژن آنزيم TTL.

4-1-1- انتخاب بهترين کلني از نظر بيان آنزيم TTL
کلنيهاي 1 تا 6 حاصل از ترانسفورماسيون، ابتدا کشت يک شبه و سپس کشت 1% تلقيح در محيط LB حاوي آمپيسيلين ?g/ml 100 داده شدند. القاي بيان پروتئين به کمک IPTG با غلظت mM 1 به مدت 6 ساعت انجام شد. سلولهاي باکتري بيان کننده پروتئين نوترکيب به کمک سانتريفوژ جمعآوري شده و با غلظت 10 برابر در بافر تريس حل شدند. در مرحله بعد ابتدا با فريز و ذوب کردن سلولها و سپس به کمک آنزيم ليزوزيم و استفاده از امواج صوتي، ديواره سلولي و غشاي باکتريها تخريب شدند. سپس پروتئينهاي دناتوره شده و قطعات ديوارههاي سلولي تخريب شده، به کمک سانتريفوژ رسوب داده شدند. عصاره سلولي حاوي آنزيم TTL جمعآوري شد و ميزان فعاليت آنزيم موجود در آن مورد بررسي قرار گرفت. جدول 4-1 ميزان فعاليت هيدرولازي آنزيم TTL در عصارههاي سلولي کلنيهاي حاصل از ترانسفورماسيون را نشان ميدهد. کمترين فعاليت آنزيمي ديده شده مربوط به کلني شماره 4 به ميزان U/ml 040/0 است و بيشترين فعاليت ليپازي در مورد کلنيهاي 3 و 6 با مقادير 106/0 و 093/0 U/ml ديده شد. هر چند با بررسي غلظتهاي پروتئيني و محاسبه فعاليت ويژه (Unit/mg Protein) آنزيم موجود در مخلوط پروتئين، مشاهده شد که کلني 6 فعاليت ويژه بيشتري نسبت به کلني 3 دارد. بنابراين کلني شماره 6 به عنوان بهترين کلني توليد کننده TTL انتخاب شد.

4-1-2- بهينه سازي زمان پس از القا توسط IPTG با غلظت mM 1
جهت بررسي ميزان بيان پروتئين در ساعتهاي مختلف پس از القا، 1 ميلي ليتر از محيط باکتري در زمانهاي مشخص رسوب داده شد و در بافر SDS-PAGE حل شد. سپس ?l 30 از هر کدام از نمونههاي سلولي به درون چاهکهاي SDS-PAGE وارد شد. بيان پروتئين نوترکيب در زمان 4 ساعت پس از القا کم و پس از 5 ساعت افزايش نشان داد. در زمان 6 ساعت بالاترين بيان پروتئين مشاهده شد و پس از گذشت 24 ساعت تغييري در ميزان بيان پروتئين نوترکيب ديده نشد. بنابراين زمان 6 ساعت به عنوان بهترين زمان برداشت سلولها پس از القا انتخاب شد.

جدول 4-1- فعاليتهاي ليپازي عصارههاي سلولي کلنيهاي 1 تا 6 حاصل از ترانسفورماسيون
شماره کلني
تعداد واحد آنزيم در ميليليتر (U/ml)
غلظت پروتئين (mg/ml)
Unit/mg Protein
1
079/0
78/1
044/0
2
066/0
42/2
027/0
3
106/0
03/2
052/0
4
040/0
02/2
020/0
5
079/0
41/1
056/0
6
093/0
67/1
056/0

4-2- تخليص آنزيم ليپاز TTL
4-2-1- بهينه سازي تخليص نسبي به روش رسوب دهي دمايي
به منظور حذف بيشترين تعداد ممکن از پروتئينهاي ناخالصي موجود در عصاره سلولي و در ضمن حفظ بيشترين تعداد ممکن از آنزيم TTL، بازههاي زماني مختلفي (30، 40، 50، 60، 70، 80 دقيقه) براي انجام فرآيند رسوب دهي دمايي مورد بررسي قرار گرفت. سپس ميزان حذف پروتئينهاي ناخالصي در هر نمونه با بکارگيري روش SDS-PAGE نشان داده شد. ميزان کل پروتئينها در هر چاهک ?g 12 بود. SDS-PAGE مربوط به رسوب دهي دمايي مخلوط پروتئيني، در بازههاي زماني مختلف (شکل 4-2) نشان ميدهد که پس از 40 دقيقه دمادهي در °C 65 بيشترين ميزان حذف پروتئينهاي ناخالصي اتفاق افتاده است. از آنجا که آنزيم TTL مربوط به يک آرکئاباکتر ترموفيل ميباشد، بيان اين ليپاز در باکتري E. coli اين امکان را فراهم مينمايد که با اعمال تيمار حرارتي برخي از پروتئينهاي ميزبان را حذف نمود. همچنين در بازههاي زماني طولانيتر، حذف بيشتري از ناخالصيها ديده نميشود. بنابراين براي به حداقل رساندن اثر منفي حرارتدهي بر ساختار آنزيم TTL، بهينه زمان رسوب دهي دمايي، 40 دقيقه انتخاب شد.

شکل 4-2- بهينه سازي مدت زمان تخليص به روش

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید