اختلاف زياد فعاليت باقيمانده آنزيم پس از دمادهي در محيط مايعات يوني نسبت به محيط بافري نشان دهنده اثر بسيار مطلوب مايعات يوني در حفظ پايداري آنزيم است که دلايل احتمالي اين اثر پيش از اين گفته شد. در اين ميان [C6MIM][Br] با اختلاف کمي نسبت به [C2MIM][Br] و [C4MIM][Br]، محيط مناسبتري را براي حفظ پايداري آنزيم فراهم ميکند.
با مقايسه پايداري آنزيم در اين مايعات يوني ميتوان دريافت که طول زنجيره کاتيوني اثر کمي در ميزان اختلاف پايداري آنزيم در اين محيطها دارد. هرچند طولهاي بسيار بالاي زنجيره کاتيوني مايعات يوني ايميدازوليومي اثر منفي بر پايداري ساختار آنزيم ميگذارند. مايعات يوني که در کاتيون خود زنجيره آلکيلي بلند دارند، در محيط آبي مانند سورفاکتانت عمل ميکنند و بر فعاليت و پايداري آنزيم به شدت اثر ميگذارند (Greaves et al., 2008, Tariq et al., 2012). گزارشات متعددي مبني بر اثر طول زنجيره مايعات يوني بر پايداري و فعاليت آنزيمها وجود دارد. Attri و همکاران دريافتند که مايعات يوني با کاتيون ايميدازوليوم و فسفونيوم هرچقدر زنجيره آلکيل بلندتر و در نتيجه آبگريزي بيشتري داشته باشند عامل پايدارکننده ضعيفتري براي ?-کيموتريپسين به حساب ميآيند (Attri et al., 2011).
همانطور که در بخش 4-6-2-3 نشان داده شد، با تغيير نوع کاتيون از پايه ايميدازوليوم به پايه پيريدينيوم تغيير زيادي در ميزان پايداري ديده نميشود. مايع يوني [C5Py][Br] نيز مانند مايعات يوني ايميدازوليومي با طول مشابه ([C4MIM][Br] و [C6MIM][Br]) باعث حفط پايداري آنزيم در حدود 60 درصد طي يک ساعت دمادهي در دماي °C85 ميشود. همچنين مايع يوني [C12Py][Br] به طور مشابهي نسبت به مايع يوني متناظر ايميدازوليومي ([C12MIM][Br]) هيچ اثر مطلوبي بر پايداري دمايي آنزيم نداشته است. در اين مورد Yamamoto و همکاران مشاهده کردند که افزايش طول زنجيره کربني در مايع يوني [CnPy][Br] باعث ناپايدار شدن آنزيم ليزوزيم ميشود (Yamamoto et al., 2011). علت احتمالي اين پديده ايجاد برهمکنشهاي آبگريز قوي بين آنزيم و زنجيره بزرگ کاتيوني آبگريز مايع يوني گزارش شده است.

5-3- بررسي ساختار سوم آنزيم در حضور مايعات يوني
اسپکتروسکوپي فلورسانس يک ابزار مرسوم براي بررسي تغييرات کنفورماسيون پروتئين است. در اين بخش از پژوهش جهت ايجاد درک بهتر از مکانيسم پايدارسازي آنزيم توسط مايعات يوني از تکنيک فلورسانس جهت بررسي ساختار آنزيم TTL، پس از مجاورت با مايعات يوني مختلف در دماي °C85 و سرد سازي در يخ، استفاده شد.
آنزيم TTL داري دو آمينواسيد تريپتوفان در ساختار خود ميباشد که در اين روش ميزان نشر فلورسانس اين آمينواسيد پس از برانگيخته شدن در طول موج nm 295، مورد بررسي قرار گرفت. بيشينه ميزان شدت فلورسانس (IMax) و بيشينه طول موج نشر (?Max)، تغييرات کنفورماسيون آنزيم را در حضور مايعات يوني مختلف و در عدم حضور مايع يوني نشان ميدهد (Bekhouche M., 2012). زماني که ساختار آنزيم باز شود اين باقيماندههاي کروموفور در معرض حلال آبدوست قرار ميگيرند و در نتيجه شدت نشر فلورسانس آنها با قرارگيري در فضاي آبدوست کاهش مييابد. البته اين امر ميتواند به دليل پوشانده شدن عوامل فلوروفور پروتئين (Trp) توسط يونهاي مايع يوني نيز باشد.
کاهش شديد نشر فلورسانس پروتئين به سبب باز شدن ساختار دوم پروتئين و قرارگيري باقيمانده هاي Trp در معرض حلال آبدوست مشاهده ميشود. چنين پديده اي در اثر حرارت دهي به آنزيم TTL در محيط بافري ديده شد. همانطور که در بخش 4-6-2 اين پژوهش نيز نشان داده شد، آنزيم TTL در فضاي بافري در دماي ?C 85 پايدار نيست و در اثر حرارت دهي ساختار آنزيم باز شده و با قرارگيري باقيمانده هاي Trp در معرض حلال آبدوست، کاهش نشر فلورسانس را سبب خواهد شد.
طيف هاي نشري فلورسانس آنزيم TTL پس از انکوباسيون آنزيم در مايعات يوني[C4MIM][PF6] و [C6MIM][PF6] و سپس خارج کردن آنزيم از اين محيط و وارد کردن آن به فضاي آبي، گرفته شدند. بالا بودن شدت نشر فلورسانس در مورد آنزيم انکوبه شده در [C4MIM][PF6] نشان دهنده حفظ فشردگي ساختاري TTL در اين محيط، حتي پس از 1 ساعت حرارت دهي در ?C 85 است. شدت نشر فلورسانس مربوط به [C6MIM][PF6] پايينتر از [C4MIM][PF6] است. هرچند، کاهش ?Max در مورد محيط [C6MIM][PF6] را مي توان به فشردهتر شدن ساختار پروتئين در اين محيط که آبگريزتر و داراي گرانروي بالاتري نسبت به [C4MIM][PF6] است، مرتبط دانست.
بنابراين با توجه به مشاهدات ساختاري بر اساس طيف هاي فلورسانس و بررسي هاي سينتيکي فعاليت آنزيمي در حضور اين مايعات يوني مي توان گفت آنزيم TTL در محيط [C4MIM][PF6] پايداري دمايي بيشتري هم از نظر ساختاري و هم از نظر حفظ فعاليت سينتيکي را داشته است.
بررسي ساختار TTL در محيط [C4MIM][PF6] در زمان هاي مختلف حرارت دهي نشان ميدهد که آنزيم تا حد زيادي ساختار خود را حفظ کرده است. کاهش اندک نشر فلورسانس پس از 30 و 60 دقيقه حرارت دهي در ?C 85 گوياي حفظ باقيمانده هاي Trp در جايگاه درون ساختاري خود ميباشند. همچنين تفاوت زياد موجود در بيشينه نشر فلورسانس مربوط به آنزيم حرارت داده شده در ?C 85، نسبت به آنزيم کاملا غيرفعال (2 ساعت حرارت دهي در ?C100 در بافر تريس mM 50)، بيانگر حفظ پيچيدگي ساختاري در محيط اين مايع يوني است. علت اين امر همانطور که پيش از اين نيز در بخش سينتيکي گفته شد آبگريزي بالاي مايع يوني است که سبب حفظ آب ضروري اطراف آنزيم مي شود. همچنين بزرگي ملکولهاي اين نوع مايعات يوني سبب تشکيل ساختارهاي شبکه مانندي مي شود که انعطافپذيري ملکول آنزيم را کم کرده و در هنگام افزايش دماي محيط مانع از باز شدن ساختار آنزيم و دناتوره شدن پروتئين ميشود.

فصل ششم

نتيجه گيري و پيشنهادات

6-1- نتيجه گيري

به منظور بررسي اثر مايعات يوني مختلف بر فعاليت و پايداري آنزيم TTL، 10 نوع مايع يوني براي تيمار آنزيم TTL مورد استفاده قرار گرفتند. در محدوده غلظتي خاصي، افزايش فعاليت هيدرولازي TTL در حضور مايعات يوني [CnMIM][Br] ديده شد. غلظت بهينه با اثر مثبت بر فعاليت هيدرولازي آنزيم، در مورد تمام مايعات يوني کمتر از CMC بود و با افزايش طول زنجيره کربني کاتيون اين غلظت کاهش يافت. آنزيم TTL در مايعات يوني داراي کاتيونها با زنجيرههاي متوسط آلکيلي ([C4MIM][Br]، [C6MIM][Br] و [C5Py][Br]) پايداري دمايي بالايي را در °C 85 از خود نشان داد. در مقايسه بين دو نوع آنيون، آنزيم TTL در مايع يوني داراي آنيون آبگريز PF6- پايدارتر بود. بررسي طيفهاي فلورسانس مربوط به اين نمونهها نيز حفظ پايداري TTL در مايعات يوني ذکر شده را نشان داد. بنابر نتايج حاصل از اين پژوهش، آنيونهاي آبگريز و کاتيونهايي با طول زنجيره آلکيلي متوسط، گزينههاي خوبي براي طراحي مايعات يوني مناسب جهت استفاده به عنوان حلال در واکنشهاي کاتاليز شده توسط آنزيم TTL هستند.

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید