مقايسه اثر نوع آنيون
52
شکل 4-9- نمودار مقايسه اثر مايعات يوني با طولهاي مختلف زنجيره کربني کاتيون ايميدازوليوم بر پايداري دمايي آنزيم TTL
53
شکل 4-10- نمودار بررسي اثر نوع کاتيون بر پايداري دمايي آنزيم TTL
53
شکل 4-11- طيف فلورسانس آنزيم TTL در بافر تريس mM 50 پس از حرارتدهي در °C 85
54
شکل 4-12- طيفهاي فلورسانس مربوط به آنزيم TTL انکوبه شده در مايعات يوني ايميدازوليومي با آنيون PF6
55
شکل 4-13- طيف فلورسانس آنزيم TTL انکوبه شده در مايع يوني [C4MIM][PF6]
55

فصل اول

مقدمه

1-1- آنزيمها
آنزيم ها کاتاليزورهاي زيستي بسيار کارآ هستند که ميتوانند سرعت واکنشها را تا 17 برابر افزايش دهند(Agarwal, 2006). بخشي از زيست توده1 زمين ليپيدها هستند و آنزيمهاي ليپوليتيک2 نقش مهمي در حذف اين مواد نامحلول در آب را دارند. آنزيمهاي ليپوليتيک در شکستن و حرکت دادن ليپيدها درون سلولهاي يک جاندار و انتقال ليپيدها از يک جاندار به جاندار ديگر نقش دارند (Beisson et al., 2000).
آنزيمها مزاياي زيادي در انجام واکنشها دارند که از جمله آنها ميتوان اختصاصيت بالاي آنها، انجام واکنش در شرايط معتدل، کاهش مواد زائد، تعيين نوع محصول و کاهش محصولات جانبي با انتخاب آنزيم مناسب، کاهش هزينهها و سرمايه لازم در مقياس بزرگ، کاهش اتلاف هزينه در فرآيندهاي آنزيمي، زيست تخريب پذير بودن آنزيمها، کاهش ميزان مصرف کاتاليزور (آنزيم) به ميزان 1%- 1/0% سوبسترا را نام برد؛ بنابراين سهم آنزيم در3BOD جريان مواد زائد بسيار ناچيز است (Posorske et al., 1984).
آنزيمهاي ميکروبي کارآتر از انواع گياهي و جانوري هستند. آنزيمهاي ميکروبي داراي تنوع عملکردي بالا، بازده بالا، دستورزي ژنتيکي آسان، منبع مشخص (که اين به دليل نبود نوسانات فصلي، رشد سريع باکتري و محيط رشد ارزان قيمت آن ميباشد)، پايداري بيشتر و توليد آسانتر نسبت به انواع گياهي و جانوري هستند (Wiseman et al., 1995). رشد سريع باکتريها و بنابراين آسانتر بودن فرآيندهاي غربالگري در مورد آنها، باعث تسهيل فرآيندهايي همچون دست ورزي ژنتيکي و ايجاد تغييرات در محيط اطراف سلول، در جهت دستيابي به بيشترين توليد آنزيم، افزايش فعاليت آنزيمي سلولها، ايجاد روند توليد پيوسته يا توليد القايي ميشوند. تنها حدود دو درصد از گونههاي ميکروبي به عنوان منبع آنزيم بررسي شدهاند که در اين ميان سويه هاي باکتريايي به دليل فعاليت بالاتر، pH بهينه خنثي يا قليايي و مقاومت به دما، بيشتر از مخمرها مورد استفاده قرار گرفتهاند (Frost and Moss, 1987).

1-2- ليپازها
ليپازها اولين بار در سال 1901 در باکتريهاي Bacillus prodigiosus، B. pyocyaneus و B. fluorescens (با نامهاي امروزي Serratia marcescens، Pseudomonas aeruginosa و Pseudomonas fluorescens ) شناسايي شدند (Eijkman et al., 1901). باکتريهاي گفته شده هماکنون بيشترين مطالعات ليپازي را به خود اختصاص دادهاند. حدود 300 سال از آغاز مطالعات روي آنزيمهاي هيدروليز کننده تريگليسريدها ميگذرد و حدود 70 سال است که توانايي ليپازها در کاتاليز واکنشهاي هيدروليز و سنتز استرها تشخيص داده شده است (Van Der Walle et al., 1927)
در سال 1856، Claude Bernard اولين آنزيم ليپاز را (آنزيم تجزيه کننده قطرات روغن نامحلول به محصولات محلول) در شيره پانکراس کشف کرد. انسانها در قديم ليپاز را از پانکراس حيوانات به صورت خالص يا به صورت مخلوط با ساير آنزيمهاي پانکراس ميگرفتند و از آن به عنوان کمک هضمکننده غذا استفاده مينمودند. به دليل کوچک بودن پانکراس و سخت بودن جمعآوري آنزيم از آن، دانشمندان به سراغ ليپازهاي ميکروبي رفتند. ليپازها از نظر نوع منشأ ( باکتري، قارچ يا پستاندار و غيره) و از نظر خصوصيات متفاوت هستند. اين آنزيمها داراي توانايي کاتاليز واکنشهاي مختلفي از جمله واکنشهاي هيدروليزي4، يا سنتز کربوکسيليکاستر5هاي مختلف و تبديل آنها به اسيدهاي آلي و گليسرول هستند. همه ليپازها اختصاصيت بسيار بالايي براي سوبستراهاي گليسريدي دارند.
آنزيمهاي ليپولايتيک به دليل کاربرد فراواني که در بيوتکنولوژي دارند ( به عنوان مهمترين گروه بيوکاتاليزورها در بيوتکنولوژي)، بسيار مورد توجه قرار گرفتهاند (Benjamin et al., 1998). توليد انبوه ليپازهاي ميکروبي نيازمند بيان شديد و کارآ از ژنهاي مربوطه و فهم دقيق مکانيسم ملکولي نحوه پيچش پروتئين و ترشح آن ميباشد. از جمله کاربردهاي جديد ليپازها در بيوتکنولوژي ميتوان استفاده از اين آنزيم در سنتز بيوپليمر6، بيوديزل7، داروهاي خالص انانتيومري، مواد شيميايي مورد استفاده در کشاورزي ( مانند انواع آفت کش)، ترکيبات طعمدهنده نام برد (Jaeger et al., 2002). بسياري از مواد شيميايي مهم صنعتي، به دست آمده از روغنها و چربيها طي فرآيندهاي شيميايي را ميتوان به کمک ليپازها با سرعت بيشتر، اختصاصيت بهتر و در شرايط معتدل به دست آورد (Sih CJ et al., 1989, Vulfson et al., 1994). جهتگزيني8 بالاي ليپازها و اختصاصيت بالاي شيميايي و انانتيومري آنها توجه بسياري از دانشمندان و صنعتگران را به خود جلب کرده است (Saxena et al., 2003).
ليپازهاي گرفته شده از منابع مختلف باکتري، قارچ، گياه و حيوان، بسته به نوع منشأ، از نظر اختصاصيت به موقعيت پيوند، اختصاصيت به اسيدچرب، پايداري دمايي و pH بهينه و غيره متفاوت هستند (Huang et al., 1984). گونههاي متعددي از باکتريها، مخمرها و قارچهاي رشتهاي توانايي توليد ليپاز دارند (جدول1) سويه هاي نزديک به هم (از نظر تاکسونومي) ممکن است انواع مختلفي از ليپاز ها را توليد کنند (Sharma et al., 2001).

جدول 1-1- ميکروارگانيسمهاي توليد کننده ليپاز
منشأ
جنس
گونه
باکتري
Bacillus
B. megaterium

B. subtilis

B. thermoleovorans

B. thermocatenulatus

B. cereus

Pseudomonas
P. putida 3SK

P. aeruginosa

P. fluorescens

P. fragi

Staphylococcus
S. canosus

S. hyicus

S. haemolyticus

S. aureus

S. warneri

S. xylosus
قارچ
Penicillium
P. cyclopium

P. simplicissimum

Aspergillus
A. niger

A. oryzae

Rhizopus
Rhizop. delemar

Rhizop. oryzae

Rhizop. arrhizus

Rhizop. nigricans

Rhizop. nodosus
مخمر
Candida
C. rugosa

C. tropicalis

C. antarctica

ليپازها را ميتوان براساس اختصاصيت به سه گروه تقسيم کرد (Mukherjee et al., 1994). ليپازهاي غير اختصاصي ملکولهاي آسيل گليسرول را در موقعيتهاي تصادفي ميشکنند و اسيدچرب آزاد و گليسرول و منوآسيل گليسرول و ديآسيلگليسرول را به عنوان حدواسطهاي واکنش ايجاد ميکنند. محصولات اين واکنش مشابه محصولات واکنش انجام شده توسط کاتاليزورهاي شيميايي است. در واکنش آنزيمي محصول در اثر دما کمتر تجزيه ميشود و اين به دليل پايينتر بودن دماي واکنش در کاتاليز زيستي است. ليپازهاي اختصاصي به موقعيتهاي 1و3، آزادسازي اسيدچرب از موقعيتهاي 1و3 اسکلت گليسرولي را کاتاليز ميکنند. ليپازهاي داراي اسيدچرب اختصاصي، تنها يک اسيدچرب خاص از ملکول آسيل گليسرول آزاد ميکنند (Macrae et al., 1983). ليپازها همچنين تفکيک انانتيومري ترکيبات کايرال و واکنشهاي استريفيکاسيون، ترانساستريفيکاسيون9، و اينتراستريفيکاسيون10 را کاتاليز ميکنند. اين تواناييهاي متنوع کاتاليز، در شکست چربيها، اصلاح چربيها و روغنها، سنتز ترکيبات آلي، تأمين شويندهها و روشهاي تجزيهاي، کاربرد بسياري پيدا کرده است (Macrae et al., 1985).

1-2-1- ارتباط ساختار آنزيم ليپاز با عملکرد آن
اين خصوصيت ليپازها که در سطح بين فضاي آبدوست و آبگريز عمل ميکنند، وجه تمايز ليپازها از استرازها ميباشد (Cleasby et al., 1992). وزن ملکولي آنزيمهاي ليپاز در محدوده 20000 تا 60000 دالتون ميباشد. اين آنزيمها نيز شبيه سرينپروتئازها داراي مجموعه سه تايي کاتاليتيک باقيمانده نوکلئوفيل- باقيمانده هيستيدين- باقيمانده اسيدي هستند (شکل1-1) که به صورت مجموعه سرين- هيستيدين- آسپارتات يا به صورت مجموعه سه تايي سرين- هيستيدين- گلوتامات ميباشد (Noble et al., 1993).
جايگاه فعال بهطور معمول در درون ملکول دفن شده است که توسط باقيماندههاي آبگريز احاطه ميشود. يک ساختار مارپيچ پليپپتيدي همانند يک درپوش مانع از قرارگيري جايگاه فعال و سوبسترا در دسترس حلال ميشود. همچنين محافظت از آنزيم در برابر فعاليت پروتئازها ممکن است با ممانعت از عملکرد مجموعه سه تايي کاتاليتيک پروتئاز ايجاد شود (Brady et al., 1990). سمتي از درپوش که روبروي جايگاه فعال است بيشتر از زنجيرههاي جانبي آبگريز آليفاتيک تشکيل شده است و در سمت مقابل، سطح آبدوست است که به سمت بيرون قرار گرفته است.
تغيير جهتگيري ساختار ?- هليکس درپوش همراه با افزايش آبگريزي سطوح نزديک جايگاه فعال و روبروي آن، باعث پديده “فعال شدن در فضاي بينابيني”11 ميشود. باز شدن درپوش ممکن است با برخورد آنزيم به مرز روغن/ آب آغاز شود (Cleasby et al., 1992). در مورد سوبستراهاي آبگريز، اتصال زنجيرههاي آليفاتيک سوبسترا به سطح آبدوست آنزيم، به ويژه در حضور يک لايه آبپوشي، بسيار نامطلوب است. فضاي بينابيني ايجاد شده در دهانه شيار فعال ممکن است به فراهم سازي يک لايه ناکامل آبپوشي در اطراف ملکول ليپاز و در نتيجه تسهيل پيچش زنجيرههاي آليفاتيک ملکول سوبسترا در سطح آنزيم کمک کند (Petersen et al., 1996). پايدارسازي بيشتر ميتواند به کمک محدودههاي الکتروستاتيک موضعي در سطح آنزيم و با ايجاد جاذبه دوقطبي به سمت پيوند C-H (با قطبيت ضعيف) زنجيرههاي جانبي آليفاتيک فراهم شود.

شکل 1-1- آنزيم ليپاز ريزوموکور ميهي12 (PDB entry 3TGL).
آمينواسيدهاي اصلي جايگاه فعال با رنگ قرمز نشان داده شدهاند: Ser144، Asp203و His257.

1-3- آنزيمها در محيط آلي
کليبانو با انجام تعدادي آزمايش ابتدايي و ساده نشان داد که ميتوان از آنزيمها در حلالهاي آلي آبگريز استفاده کرد(Zaks and Klibanov, 1985, Klibanov et al., 1986) ، هرچند که در چنين محيطهايي سرعت واکنش به شدت پايين ميآيد (Klibanov et al., 1997). به مرور مشخص شد که بسياري از ليپازها و همچنين برخي از پروتئازها و آسيلازها بسيار پايدار هستند، به طوري که حتي در حلالهاي آلي بدونآب نيز فعاليت خود را حفظ ميکنند. اين خصوصيت اساس استفاده موفقيتآميز از اين آنزيمهاي هيدرولاز در واکنشهاي غيرهيدرولازي است. از جمله اين واکنشهاي غيرهيدرولازي ميتوان آسيلاسيون الکلها و آمينها با اختصاصيت انانتيومري را نام برد که در صنعت کاربرد زيادي دارند) (Schmidt et al., 2001.
تداخل محيط آلي، که شامل مايعات يوني13 نيز ميشود، با فعاليت آنزيم غالبا از جنبه حذف آب ضروري آنزيم مورد بررسي قرار ميگيرد. بسياري از آنزيمها براي فعال بودن به يک پوشش آبي کامل نياز دارند، اما تعداد زيادي استثناء نيز وجود دارد مانند ليپاز B کانديدا آنتراکتيکا14 (CALB) که فعاليت خود را حتي پس از خشک شدن با پنتوکسيد فسفر حفظ ميکند (De Goede et al., 1993) و پروتئاز سوبتيسيلين که براي فعال ماندن تنها نياز به تعداد اندکي ملکول آب با اتصال محکم به ملکول آنزيم دارد (Dolman et al., 1997). بررسي منابع علمي نشان ميدهد که بيان نياز آنزيم به آب در قالب فعاليت آبي (aW ) مرسومتر از بيان آن بر اساس غلظت آب است. حضور مقدار کم آب هنگام انجام واکنشهاي غيرهيدرولازي با آنزيمهاي ليپاز يا پروتئاز ممکن است باعث حفظ يا افزايش فعالي

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید